Основні терміни

Жирним шрифтом виділено терміни, значення яких наведено у словнику

конформація

нативна конформація

сольватний шар

пептидна група

діаграма Рамачандрана

вторинна структура

α-спіраль

β-конформація

β-складка

β- поворот

третинна структура

четвертинна структура

фібрилярні протеїни

ґлобулярні протеїни

α-кератин

колаґен

фіброїн шовку

надвторинна структура

мотив

згортка

домен

родина протеїнів

мультимер

оліґомер

протомер

симетрія

денатурація

розплавлена ґлобула

молекулярний шаперон

Hsp70

шапероніни

пріон

Завдання

1. Властивості пептидного зв'язку. Під час рентґеноструктурного дослідження кристалів пептидів Лайнус Полінґ і Роберт Корі встановили, що зв'язок С-N у пептидах має довжину 1,32 Å, це значення є проміжним між типовими величинами довжин одинарних С-N (1,49 Å) і подвійних С=N (1,27 Å) зв'язків. Вони також знайшли, що пептидний зв'язок плоский (всі чотири з'єднані з С-N атоми перебувають в одній площині) і що два зв'язані з С-N α-вуглецеві атоми завжди знаходяться в транс-положенні один до одного (тобто по різні боки пептидного зв'язку).

(а) Як пов’язана довжина зв'язку С-N в пептидах із його міцністю і порядком (тобто, він одинарний, подвійний чи потрійний)?

(б) Які висновки шодо можливості обертання навколо пептидного зв'язку С-N можна зробити на підставі спостережень Полінґа і Корі?

2. Співвідношення між структурою і властивостями фібрилярних протеїнів. За допомогою рентґеноструктурного аналізу шерсті Вільям Астбері встановив наявність структурної одиниці розміром 5,2 Å, яка повторюється вздовж волокна. Після обробки водяною парою і розтягнення волокна, на рентґенограмі було виявлено нову періодичну структурну одиницю розміром 7,0 Å. Якщо шерсть обробити парою, розтягнути, а потім дати їй збігтися, то на рентґенограмі знову буде видно вихідну структуру розміром близько 5,2 Å. Ці спостереження дали важливий ключ до розуміння молекулярної структури шерсті, проте в той час Астбері не зміг їх пояснити.

(а) Поясніть отримані Астбері результати на підставі сучасного розуміння структури шерсті.

(б) Коли шерстяний светр або шкарпетки випрати в гарячій воді чи висушити гарячим повітрям, вони збігаються. Шовкові тканини після такої ж обробки не змінюються. Поясніть, чому.

3. Швидкість синтезу α-кератину волосся. Волосся росте зі швидкістю 15 - 20 см на рік. Процес росту відбувається в основі волосини, де всередині живих клітин епідермісу філаменти α-кератину синтезуються і з'єднуються у канатоподібні структури (див. Рис. 4-11). Основним структурним елементом α-кератину є α-спіраль, яка містить 3,6 амінокислотних залишки на один виток завдовжки 5,4 Å (див. Рис. 4-4б). Приймемо, що синтез α-спіральних ланцюгів кератину є лімітуючим фактором швидкості росту волосся. Обчисліть швидкість синтезу пептидних звязків в α-кератинових ланцюгах (виражену у кількості пептидних зв'язків, утворених за секунду) на основі даних про річну швидкість росту волосся.

4. Вплив рН на конформацію α-спіральних вторинних структур. Розгортання α-спіралі поліпептида у неупорядковану спіралізовану структуру супроводжується суттєвим зменшенням величини питомого обертання, яке вимірюється здатністю розчину повертати плоскополяризоване світло. Поліглутамат, поліпептид із залишків L-Glu, за рН 3 має конформацію α-спіралі. У разі зростання значення рН до 7 відбувається значне зменшення величини питомого обертання. Подібним же чином полілізин (полімер із залишків L-Lys) утворює α-спіраль за рН 10, але у разі зменшенні рН до 7 також спостерігається зменшення питомого обертання, як це видно з графіка:

(графік) збоку - Питоме обертання

α-Спіраль Полі(Glu) α-Спіраль Неупорядкована конформація Полі(Lys) Неупорядкована конформація

Як можна пояснити вплив зміни рН на конформації полі(Glu) і полі(Lys)? Чому перехід відбувається в такому вузькому інтервалі рН?

5. Дисульфідні зв'язки визначають властивості багатьох протеїнів. Деякі природні протеїни містятъ значну кількість дисульфідних зв'язків, причому їхні механічні властивості (міцність, в'язкість. твердість і т.д.) корелюють із вмістом цих зв'язків. Наприклад, глютенін, протеїн зерна пшениці зі значним вмістом дисульфідних зв'язків, забезпечує пружність і еластичність пшеничного тіста. Аналоґічно твердість і міцність панцира черепахи зумовлена великою кількістю дисульфідних зв'язків в його α-кератині.

(a) Яка молекулярна основа кореляції між вмістом дисульфідних зв'язків і механічними властивостями протеїну?

(б) Більшість ґлобулярних протеїнів денатурується і втрачає свої властивості при нетривалому нагріванні до 65^оС. Однак денатурацію ґлобулярних протеїнів з численними дисульфідними зв'язками потрібно провадити довше і за вищої температури. Один з таких протеїнів - інгібітор трипсину з підшлункової залози бика - складається із одного ланцюга, що містить 58 амінокислотних залишків і три дисульфідні зв'язки. Під час охолодження розчину денатурованого протеїну його активність відновлюється. Яке молекулярне підґрунтя цієї властивості?

6. Амінокислотна послідовність і структура протеїнів. Сучасне розуміння механізму згортання протеїнів дозволяє дослідникам робити припущення щодо їх структури на підставі даних про первинну амінокислотну послідовність.

(формула)

(а) Де ви передбачаєте існування згинів чи β-поворотів у наведеній вище послідовності?

(б) Де можуть утворюватися міжланцюгові дисульфідні поперечні зв'язки?

(в) Вважаючи, що ця послідовність складає частину більшого ґлобулярного протеїну, визначте можливе розміщення (на зовнішній поверхні чи всередині протеїну) таких амінокислотних залишків: Asp, Ile, Thr, Ala, Gln, Lys. Поясніть свою арґументацію. (Підказка: гідропатичні індекси наведено в Табл. 3-1).

7. Бактеріородопсин у пурпурних протеїнах мембран. За сприятливих умов солелюбива бактерія Halobacterium halobium синтезує мембранний протеїн бактеріородопсин (М_r 26 000), який має пурпуровий колір завдяки вмісту ретиналю (див. Рис. 10-21). Молекули цього протеїну об'єднуються в мембрані клітини у "пурпурові плями". Бактеріородопсин є світлочутливою протонною помпою, яка забезпечує клітину енерґією. Рентґеноструктурний аналіз цього протеїну показує наявність семи паралельних α-спіральних сеґментів, кожний з яких пронизує мембрану бактеріальної клітини (товщина 45 Å). Обчисліть мінімальне число амінокислотних залишків, необхідних для того, щоб один сеґмент α-спіралі повністю пройшов крізь мембрану. Оцініть, яка частина бактеріородопсину припадає на спіралі, що пронизують мембрану (використайте значення ваги середнього амінокислотного залишку, яке дорівнює 110).

8. Патоґенна дія бактерій, що спричиняють газову ґанґрену. Високопатоґенна анаеробна бактерія Clostridium perfringens викликає газову ґанґрену, при якій руйнується структура тканини тварин. Бактерія виділяє ензим, який ефективно каталізує гідроліз пептидних зв'язків, позначених червоним кольором:

(рівняння)

де Х і Y - будь-яка з 20 стандартних амінокислот. Яким чином виділення цього ензиму бактерією забезпечує її проникнення в тканини людини? Чому цей ензим не впливає на бактерію?

9. Число поліпептидних ланцюгів у мультисубодиничному протеїні. Зразок (660 мг) оліґомерного протеїну з М_r 132 000 було оброблено надлишком 1-фтор-2,4-динітробензолу (реаґент Сенджера) у м'яких лужних умовах до повного завершення хімічної реакції. Після цього пептидні зв'язки протеїну були повністю гідролізовані нагріванням з концентрованою HCl. Гідролізат містив 5,5 мг такої сполуки:

(формула)

2,4-динітрофенільні похідні α-аміногруп інших амінокислот знайдені не були.

(a) Поясніть, яким чином можна використати цю інформацію для визначення кількості поліпептидних ланцюгів в оліґомерному протеїні.

(б) Обчисліть кількість поліпептидних ланцюгів у цьому протеїні.

(в) Який інший метод аналізу протеїнів можна застосувати для визначення того, однакові чи різні поліпептидні ланцюги входять до складу даного протеїна?

Біохімія в інтернеті

10. Моделювання протеїнів за допомогою інтернету. Для визначення причини хвороби Крона (запалення нутрощів) групі пацієнтів була проведена біопсія слизової оболонки кишковика. У результаті було виявлено протеїн, що має вищу експресію у пацієнтів з хворобою Крона, ніж у пацієнтів з іншими видами запалень та здорових людей. Протеїн виділили і встановили наступні амінокислотні послідовності його фраґментів (читати зліва направо)

(послідовності)

(а) Ідентифікуйте цей протеїн за базами даних в інтернеті. Починати варто з Proteіn Information Resource (PIR; pir.georgetown.edu/pirwww), Structural Classification of Proteins (SCOP, http://scop.berkeley.edu та Prosite (http://us.expasy.org/prosite).

На вибраній вами інтернетній сторінці знайдіть проґрами для порівняння послідовностей (sequence comparison engine). Введіть близько 30 залишків з послідовності протеїну у вікно пошуку і почніть аналіз. Які результати ви отримаєте щодо природи протеїну?

(б) Використайте різні відрізки амінокислотної послідовності. Чи завжди результат буде той самий?

(в) Деякі веб-сторінки надають інформацію про тривимірну структуру протеїнів. Знайдіть дані про вторинну, третинну і четвертинну структури протеїну, використовуючи дані Protein Data Bank (PDB, www.rcsb.org/pdb) або SCOP.

(г) У процесі пошуку спробуйте знайти інформацію про функцію цього протеїну у клітині.

РИС. 4-1 Структура ґлобулярного протеїна - ензима хімотрипсину. Протеїни - це великі молекули, кожна з яких, як ми побачимо в подальшому, має свою унікальну структуру. Для уявлення про розмір молекул протеїнів на рисунку справа наведено зображення молекули амінокислоти ґліцину (блакитного кольору). Визначені тривимірні структури протеїнів занесено до Протеїнового Банку Даних (PDB - Protein Data Bank, www.rcsb.org/pdb). Кожній структурі приписано ідентифікаційний номер з чотирьох знаків, або PDB ID. Де це можливо, ми наводитимемо значення PDB ІD для молекулярних графічних зображень у підписах до рисунків. Наведене тут зображення було отримано з використанням даних з PDB, файл 6GCH. Дані файлів PDB містять лише набір координат щодо розташування атомів і їх зв'язків між собою. Для отримання зображень використовують нескладні у використанні графічні проґрами типу RasMol і Chime, котрі перетворюють координати в зображення і дозволяють оперувати структурою у трьох вимірах. Інструкції для завантаження Chime разом із програмою навчання наведено на інтернетній сторінці цієї книги (www.whfreeman.com/lehninger). Веб-сторінка PDB містить також інструкції для завантаження інших проґрам зображення протеїнів. Ми радимо всім студентам скористатися даними PDB і безкоштовними програмами молекулярної графіки.

РИС. 4-2 Плоска пептидна група. (а) Кожний пептидний зв'язок частково має характер подвійного зв’язка завдяки наявності резонансу і неможливості вільного обертання. (б) Три зв'язки, що розділяють сусідні α-вуглеці поліпептидного ланцюга. Навколо зв'язків N-С_α і С_α-С обертання можливе; кути їх зв'язків позначають відповідно φ і ψ. Вільне обертання навколо пептидного зв'язку С-N неможливе. Обертання навколо інших одинарних зв'язків пептидного каркасу також може мати обмеження, викликані розміром і зарядом їхніх R-груп. У наведеній конформації φ і ψ дорівнюють 180^о (або -180^о). Якщо дивитися від α-вуглецю, то кути φ і ψ збільшуються по мірі обертання карбонілу чи атомів амідного азоту (відповідно) за годинниковою стрілкою. (в) Прийнято, що значення кутів φ і ψ дорівнюють 0^о у тому випадку, коли два пептидних звязки з обох боків α-вуглецю знаходяться в одній площині і розташовані, як це наведено на рисунку. У протеїні ця конформація неможлива внаслідок просторового перекривання атомів α-карбонільного кисню і α-амінного водню. Щоб проілюструвати зв'язки між атомами, розмір кульок, які позначають кожен атом, зменшено порівняно з реальними радіусами ван дер Ваальса. 1 Å = 0.1 нм.

(а) Карбонільний кисень має частково неґативний заряд, а амідний азот - частково позитивний заряд, внаслідок чого виникає невеликий електричний диполь. Практично всі пептидні зв'язки в протеїнах мають зображену тут транс-конфіґурацію; виняток наведено на Рис. 4-8б.

(б) Амінний кінець Карбоксильний кінець

РИС. 4-3 Діаграма Рамачандрана для залишків L-Ala. Конформація пептидів визначається величинами кутів φ і ψ. Можливими вважаються ті конформації, що мають незначну або нульову стеричну інтерференцію, яка може бути розрахована на основі значень радіусів ван дер Ваальса і кутів між зв'язками. Синім кольором відмічено конформації без стеричного перекривання, тому вони повністю можливі; блакитним - конформації, можливі на межі дозволених контактів між атомами; світло-блакитним – конформації, можливі за малих відхиленнь значень кутів. Асиметрія діаграми відображає L-стереохімію амінокислотних залишків. Приблизно такими ж є діаграми для залишків інших L-амінокислот з нерозгалуженими бічними ланцюгами. Дозволені межі для залишків розгалужених амінокислот, таких як Val, Ile і Thr дещо менші, порівняно з Ala. Набагато ширший діапазон можливих конформацій характерний для залишку Gly, який має менше стеричних обмежень. У той же час для залишку Pro існує набагато більше обмежень, оскільки циклічна структура його бічного ланцюга дозволяє значення φ лише в діапазоні від -35^о до -85^о.

ψ (градуси) φ (градуси)

РИС. 4-4 Чотири моделі α-спіралі, які відображають різні аспекти її структури. (а) Утворення правозакрученої α-спіралі. Площини жорстких пептидних зв'язків паралельні довгій осі спіралі, зображеній тут у вигляді вертикального стрижня. (б) Кульково-стрижнева модель правозакрученої α-спіралі, яка демонструє внутрішньоланцюгові водневі зв'язки. Повторюваною одиницею є один виток спіралі, що охоплює 3,6 залишків. (в) Зображення α-спіралі з торця, якщо дивитися вздовж довгої осі (отримано з PDB ID 4TNC). Зауважте положення R-груп, позначених фіолетовими кульками. Кульково-стрижнева модель, що використовується для зображення спіральної конфігурації, на перший погляд дає неправильне уявлення, ніби спіраль порожня всередині, оскільки розміри кульок не відповідають радіусам ван-дер-Ваальса окремих атомів. Зображення просторової моделі (г) свідчить, що насправді атоми всередині α-спіралі розташовані дуже щільно.

Амінний кінець Карбоксильний кінець у рамці: Вуглець Водень Кисень Азот R-група

6. залишків

РИС. 4-5. Взаємодії між R-групами амінокислот, розташованих в α-спіралі на відстані трьох залишків. Просторова модель (отримана з PDB ID 4TNC) демонструє міжіонну взаємодію залишків Asp¹⁰⁰ і Arg¹⁰³ в α-спіральній ділянці кальцій-зв'язувального протеїну м'язів тропоніну С. Поліпептидний каркас (атоми вуглецю, α-амінного азоту і α-карбонільного кисню) сеґмента спіралі завдовжки 13 залишків забарвлено сірим кольором. Наведено лише бічні ланцюги Asp (червоний) і Arg (синій), які взаємодіють між собою.

РИС. 4-6 Диполь спіралі. Електричний диполь пептидного зв'язку (див. Рис. 4-2а) передається вздовж α-спірального сеґмента через внутрішньоланцюгові водневі зв'язки, зумовлюючи диполь спіралі. На цьому рисунку аміно- і карбонільні складові кожного пептидного зв'язку позначено відповідно як + і -. Незв'язані водневими зв'язками аміно- і карбонільні групи пептидних зв’язків на кінцях α-спіральної ділянки позначено червоним.

Амінний кінець Карбоксильний кінець

РИС. 4-7 β-Конформація поліпептидних ланцюгів. Наведений вигляд зверху і збоку показує розташування R-груп, які виступають із β-складки, і підкреслює складчасту форму, утворену площинами пептидних зв'язків (Альтернативна назва цієї структури - β-складчастий шар). Показано також перехресні водневі зв'язки між сусідніми ланцюгами. (а) Антипаралельна β-складка, для якої характерна протилежна орієнтація амінокінців по відношенню до карбоксильних кінців у сусідніх ланцюгах (показано стрілками). (б) Паралельна β-складка.

(а) Антипаралельна Вигляд зверху Вигляд збоку

(б) Параллельна Вигляд зверху Вигляд збоку

РИС. 4-8 Структури β-поворотів. (а) Найпоширеніші повороти типу І і ІІ; тип І зустрічаються вдвічі частіше, ніж тип ІІ. У поворотах типу ІІ третім залишком завжди є Gly. Зауважте існування в обох типах водневого зв'язку між пептидними групами першого і четвертого залишків згину. (Залишки амінокислот оточені великими блакитними колами). (б) Транс- і цис-ізомери пептидного зв'язку за участю імінного азоту залишку проліну. Окрім проліну, пептидні зв'язки між всіма іншими амінокислотними залишками у понад 99,5% випадків мають транс-конфіґурацію. Близько 6% пептидних зв'язків, що включають імінний азот проліну, знаходяться у цис-конфіґурації, яка досить часто зустрічається саме в β-поворотах.

(а) β-поворот Тип І Гліцин Тип ІІ

(б) Ізомери проліна транс цис

РИС. 4-9 Діаграми Рамачандрана для різних структур. (а) Значення φ і ψ для різних дозволених вторинних структур накладені на діаграму з Рис. 4-3. Хоча теоретично можливі і лівозакручені α-спіралі, що охоплюють кілька амінокислотних залишків, проте в протеїнах їх не знайдено. (б) На діаграму теоретично дозволених конформацій (Рис. 4-3) накладено значення φ і ψ для залишків всіх амінокислот, за винятком Gly, що входять до складу ензима піруваткінази (виділеної із кроля). Малі гнучкі залишки Gly виключені з розгляду, оскільки вони часто виявляються поза межами дозволених конформацій (позначено блакитним).

Антипаралельні β-складки Паралельні β-скадки Потрійна спіраль колаґена

Правозакручені β-складки

Лівозакручена α-спіраль

Правозакручена α-спіраль

градуси – 4 рази

РИС. 4-10 Відносна ймовірність локалізації певної амінокислоти в одному з трьох поширених типів вторинної структури.

α-Спіраль β-Конформація β-поворот.

РИС. 4-11 Структура волосини. (а) α-Кератин волосся - це видовжена α-спіраль з потовщеннями поблизу амінокінця і карбоксикінця молекули. Пари цих спіралей закручуються одна навколо іншої вліво з утворенням дволанцюгових скручених спіралей. Далі ці елементи служать основою структур вищого порядку - протофіламентів і протофібрил. Приблизно чотири протофібрили - разом 32 нитки α-кератину - об'єднуються з утворенням проміжного філаменту. Окремі дволанцюгові скручені спіралі також, очевидно, перебувають у взаємно скрученному стані у різних субструктурах, однак напрямок їхнього скручування та інші структурні деталі не з’ясовано. (б) Волосина складається із багатьох філаментів α-кератину, субструктура яких наведена в (a).

(а) α-Спіраль кератину Дволанцюгова скручена спіраль Протофіламент

Протофібрила

(б) Поперечний зріз волосини

Клітини Проміжний філамент Протофібрила Протофіламент

Дволанцюгова скручена спіраль α-Спіраль

ТАБЛИЦЯ 4-1 Вторинні структури і властивості фібрилярних протеїнів

Структура Характеристика Приклади

α-Спіраль, перехресно зв'язана дисульфідними зв’язками	Щільні нерозчинні захисні структури різної твердості і гнучкості	α-Кератин волосся, пір'я та нігтів
β-Конформація	М'які, гнучкі філаменти	Фіброїн шовку
Потрійна спіраль колаґену	Висока міцність на розрив, нездатність розтягуватися	Колаґен сухожиль та матриксу кісток

РИС. 4-12 Структура колаґену. (Отримано з PDB ID 1CGD.) (a) α-Ланцюг колаґену містить притаманну тільки цьому протеїну повторювану вторинну структуру. Повторювана трипептидна послідовність Gly-X-Pro, або Gly-X-4-Нур, утворює закручену вліво спіральну структуру, яка містить три амінокислотних залишки на один поворот. Для наведеної моделі було використано повторювану послідовність Gly-Х-4-Нур (б) Просторова модель тієї ж α-спіралі. (в) Три такі спіралі, (помічено сірим, блакитним та синім) закручені одна навколо іншої і утворюють правозакручену структуру, схожу на «канат». (г) Кульково-стрижнева модель триниткової надспіралі колаґену, вигляд з торця. Залишки Gly позначено червоним кольором. Завдяки своєму малому розміру тільки молекула гліцину може розміститися у місці тісного контакту трьох ланцюгів. Розміри кульок на малюнку не відповідають радіусам ван дер Ваальса окремих атомів. Центральна частина надспіралі не порожня, як це може здатися із рисунка, а упакована дуже щільно.

РИС. 4-13 Структура колаґенових фібрил. Молекула колаґену (M_r. 300000) має форму стрижня завдовжки близько 3000 Å і завтовшки лише 15Å. Його три скручені α-ланцюги можуть мати різні послідовності, але кожен з них містить близько 1 000 амінокислотних залишків. Волокна колаґену утворені відповідно вирівненими молекулами, зміщеними по відношенню одна до одної і перехресно зв’язаними для міцності. Особливості вирівнювання і ступінь перехресного з’єднання молекул залежать від типу тканини і утворюють на електронних мікрофотографіях характерні поперечні смуги. У наведеному тут прикладі вирівнювання групп голови кожної четвертої молекули утворює повторювані поперечні смуги, відстань між якими складає 640 Å.

250 нм Голови молекул колаґену Поперечні смуги 640 Å (64 нм)

Частина молекули колаґену.

РИС. 4-14 Структура шовку. Фібрили, з яких складається шовкова тканина або павутина павука, утворені із протеїну фіброїну. (а) Фіброїн містить шари антипаралельних β-складок, багатих на залишки Ala (фіолетові) і Gly (жовті). Невеликі бічні ланцюги взаємодоповнюють один одного, що сприяє щільній упаковці складок, як це видно на даному зображенні збоку. (б) На цій кольоровій електронній мікрофотоґрафії видно нитки фіброїну (блакитні) в момент їх виділення павуком.

Бічний ланцюг Ala Бічний ланцюг Gly 70 мкм

РИС. 4-15 Структури ґлобулярних протеїнів характеризуються компактністю і різноманітністю. Альбумін сироватки людини (M_r 64 500) містить 585 залишків в одному ланцюзі. На рисунку показано, які приблизні розміри мав би його єдиний поліпептидний ланцюг у повністю видовженій β-конформації, або у вигляді α-спіралі. Також наведено розмір молекули протеїну у його нативній ґлобулярній формі, визначений методом рентгенівської кристалографії; для набуття такого розміру пептидний ланцюг мусить згорнутися дуже щільно.

β-Конформація α-Спіраль Нативна ґлобулярна форма.

РИС. 4-16 Третинна структура міоґлобіну кашалота. (PDB ID 1MBO) Орієнтація протеїну подібна на всіх зображеннях; гемова група позначена червоним. Окрім структури міоґлобіну, цей рисунок демонструє також декілька різних способів зображення структури протеїнів. (а) Поліпептидний ланцюг наведено в запропонованій Джейн Річардсон стрічкоподібній формі, яка підкреслює ділянки вторинної структури. Чітко видно α-спіральні ділянки. (б) Зображення у вигляді "сітки" вирізняє поверхню протеїну. (в) Зображення контура поверхні зручне для візуалізації заглибин («кишень») у структурі протеїнів, які звичайно служать місцями зв'язування інших молекул. (г) Зображення стрічкоподібної стуктури з бічними ланцюгами гідрофобних залишків Leu, Ile, Val та Phe (позначено синім). (ґ) Просторова модель з бічними ланцюгами всіх амінокислот. Кожен атом зображений кулькою, розмір якої пропорційний до радіуса ван дер Ваальса. Гідрофобні залишки позначено синім кольором; більшість з них перебуває всередині молекули і невидимі на цьому зображенні.

РИС. 4-17 Гемогрупа. Ця група входить до складу міоґлобіну, гемоґлобіну, цитохрому і багатьох інших гемових протеїнів. (а) Гем містить складну орґанічну кільцеву структуру протопорфірин, з яким зв'язаний атом заліза в окисненому (Fe²⁺) стані. Атом заліза має шість координаційних зв'язків, чотири з яких знаходяться в площині плоскої молекули порфірину і зв'язані з нею, а два інші розміщені перпендикулярно. (б) У міоґлобіні і гемоґлобіні одним із перпендикулярних координаційних зв’язків є зв’язок з атомом азоту залишку His. Інший зв’язок "відкритий" і служить для зв'язування молекули О₂.

РИС. 4-18 Тривимірні структури деяких малих протеїнів. Зображено структури цитохрому с (PDB ID 1CCR), лізоциму (PDB ID 3LYM) і рибонуклеази (PDB ID 3RN3). Зображення кожного протеїну наведено у вигляді контура поверхні і стрічкоподібної структури, орієнтація однакова. У стрічкоподібній структурі ділянки у β-конформації позначені плоскими стрілками, а α-спіралі – спіральними стрічками. Головні функціональні групи (гем в цитохромі с, амінокислотні бічні ланцюги в активних центрах лізоциму і рибонуклеази) позначено червоним, дисульфідні зв'язки (у стрічкоподібних структурах) – жовтим кольорами.

Цитохром с Лізоцим Рибонуклеаза

ТАБЛИЦЯ 4-2 Приблизна кількість α-спіралей і β-конформацій у складі деяких одноланцюгових протеїнів.

Залишків (%)*

Протеїн (всього залишків) α-Спіраль β-Конформація

Хімотрипсин (247) 14 45

Рибонуклеаза (124) 26 35

Карбоксипептидаза (307) 38 17

Цитохром с (104) 39 0

Лізоцим (129) 40 12

Міоґлобін (153) 78 0

Джерело: Cantor, C.R. & Schimmel, P.R. (1980) Biophysical Chemistry, Part I: The Conformation of Biological Mаcromolecules, p. 100, W.H. Freeman and Company, New York.

^*Окремі ділянки пептидних ланцюгів, які не входять до складу α-спіралей чи β-конформацій, утворюють згини і нереґулярно закручені чи витягнуті відрізки. Іноді сеґменти α-спіралей і β-конформацій дещо відрізняються від їхніх нормальних розмірів і ґеометрії.

РИС. 4-19 Структурні домени поліпептиду тропоніну С. (PDB ID 4TNC). Цей кальцій-зв'язувальний протеїн м'язів має два окремі кальцій-зв'язувальні домени, зображені синім і пурпуровим кольорами.

РИС. 4-20 Стабільні способи згортання в молекулах протеїнів. (а) Два прості поширені мотиви, які забезпечують існування двох шарів вторинних структур. Бічні ланцюги амінокислотних залишків на поверхні розподілу між елементами вторинної структури захищені від взаємодії з водою. Зауважте, що β-нитки в β-α-β ‑ петлі мають тенденцію закручуватися вправо. (б) З'єднання між β-нитками у шарах β-складок. Вигляд ниток показано з торця і у нескрученному стані. Товщі лінії зображають з’єднання на кінцях, ближчих до спостерігача, тонші - на віддалених кінцях β-ниток. З'єднання на певному кінці (наприклад, ближчому до спостерігача) не перетинаються між собою. (в) Завдяки скручуванню β-ниток, з'єднання між ними зазвичай закручені вправо. Лівозакручені з’єднання повинні перетинати гостріші кути і утворюються важче. (г) Два види впорядкування β-ниток, стабілізовані завдяки їхній здатності до закручування. Цей β-циліндр є окремим доменом α-гемолізину (токсин, який утворює пори, і знищує клітини за рахунок виникнення дірки в їхній мембрані) з бактерій Staphylococcus aureus (отримано з PDB ID 7AHL). Закручена β-складка міститься в домені фотоліази (протеїну, який відновлює окремі типи ушкодження ДНК) з E. coli (отримано з PDB ID 1DNP).

(а) Петля β-α-β Кут α-α

(б) Типові з'єднання в повністю-стандартному β-мотиві Перехресне з'єднання (не спостерігається)

(в) Правозакручене з'єднання між β-нитками Лівозакручене з'єднання між β-нитками (зустрічається дуже рідко)

(г) β-Циліндр Закручена β-складка

РИС. 4-21 Побудова великих мотивів із менших. Поширеним мотивом є α/β-циліндр, який утворюється із повторень простішого мотиву- петлі β-α-β. Наведений α/β-циліндр – домен піруваткінази (ґліколітичного ензиму) кроля (отримано з PDB ID 1PKN).

β-α-β‑Петля α/β-Циліндр

РИС. 4-22 Класифікація протеїнів на основі їхніх мотивів. Тут наведено лише незначну частину з сотень відомих стабільних мотивів. Їх розподіляють на чотири класи: всі α (тобто, лише α-мотиви), всі β, α/β і α+β. Також наведено стуктурну класифікацію із бази даних SCOP (Structural Classification Of Proteins, http://scop.mrc-lmb.cam.ac.ul/scop). Ідентифікатор PDB - номер, який присвоюється кожній структурі, занесеній в Протеїновий Банк Даних (www.rcsb.org/pdb). Зображений на Рис. 4-21 α/β-циліндр є прикладом ще одного особливо поширеного α/β-мотиву.

PDB - ідентифікатор

Згортка

Надродина

Родина

Протеїн

Вид

Всі α

1АО6	1BCF	1GAI	1ENH
Альбумін сироватки	Феритин-подібна	α/α тороїд	3-спіральний пучок, що зв'язує ДНК/РНК
Альбумін сироватки	Феритин-подібна	Шестишпилькова ґлікозилтрансфераза	Гомеодомено-подібні
Альбумін сироватки	Феритин	Ґлюкоамілаза	Гомеодомен
Альбумін сироватки	Бактеріоферитин (цитохром b1)	Ґлюкоамілаза	Зазубрений гомеодомен
Людина (Homo sapiens)	Escherichia coli	Aspergillus awamori, варіант х 100	Drosophila melanogaster

Всі β

1HOE	1LXA	1PEX	1JPC	1CD8
Інгібітор α-амілази тендамістат	Однонитчата лівозакручена β-спіраль	Чотирилопатевий β-пропелер	β-Призма ІІ	Імуноґлобуліноподібний β-сендвіч
Інгібітор α-амілази тендамістат	Тримерні LpxA-подібні ензими	Гемопексиноподібний домен	α-D-маннозоспецифічні лектини рослин	Імуноґлобулін
Інгібітор α-амілази тендамістат	UDP-N-ацетилґлюкоза мінацилтрансфераза	Гемопексиноподібний домен	α-D-маннозоспецифічні лектини рослин	V-група доменів (доменоподіб не варіабельне антитіло)
Інгібітор α-амілази тендамістат	UDP-N-ацетилґлюкоза мінацилтрансфераза	Колаґеназа-3 (ММР-13), карбоксикінцевий домен	Лектин (аґлютинін)	CD8
Streptomyces tendae	Escherichia coli	Людина (Homo sapіens)	Підсніжник (Galanthus nivalis)	Людина (Homo sapіens)

α/β

1DEH	1DUB	1PFK
NAD(P)-зв'язувальні домени згортки Россманна	ClpP/кротоназа	Фосфофруктокіназа
NAD(P)-зв'язувальні домени згортки Россманна	ClpP/кротоназа	Фосфофруктокіназа
Алкоголь/ґлюкозоде гідроґенази, карбоксикінцевий домен	Кротоназоподібні	Фосфофруктокіназа
Алкогольдегідроґеназа	Еноїл-CоА-гідратаза (кротоназа)	ATP-залежна фосфофруктокіназа
Людина (Homo sapiens)	Пацюк (Rattus norvegicus)	Escherichia coli

α+β

2PIL	1SYN	1EMA	1U9A
Пілин	Тимідилатсинтаза/ dCMP- гідроксиметилаза	GFP-подібна	UBC-подібна
Пілин	Тимідилатсинтаза/ dCMP - гідроксиметилаза	GFP-подібна	UBC-подібна
Пілин	Тимідилатсинтаза/ dCMP - гідроксиметилаза	Флюоресцентні протеїни	Убіквітин-кон'юґуючий ензим, UBC
Пілин	Тимідилатсинтаза	Зелений флюоресцентний протеїн, GFP	Убіквітин-кон'юґуючий ензим, UBC
Neisseria gonorrhoeae	Escherichia coli	Медуза (Aequorea victoria)	Людина (Homo sapiens) ubc9

Портрети - Макс Перутц (зліва) Джон Кендрю (справа)

РИС. 4-23 Четвертинна структура дезоксигемоґлобіну. (PDB ID 2HHB). Аналіз дезоксигемоґлобіну (гемоґлобіну, який не містить молекул кисню, зв’язаних з гемовими групами) методом дифракції рентгенівських променів допоміг з’ясувати спосіб спільної упаковки чотирьох субодиниць. (а) Зображення у вигляді стрічкоподібної структури. (б) Просторова модель. α-Субодиниці зображено сірим і блакитним кольорами, β-субодиниці - рожевим і синім. Зауважте, що групи гему (червоні) віддалені одна від одної.

РИС. 4-24 Обертова симетрія в протеїнах. (а) У випадку циклічної симетрії субодиниці суміщаються внаслідок обертання навколо однієї осі n-го порядку, де n - кількість субодиниць. Осі позначено чорними лініями, цифри відповідають значенню n. На рисунку наведено лише дві з багатьох можливих С_n – конфігурацій. (б) У випадку діедричної симетрії всі субодиниці можуть суміститися шляхом обертання навколо однієї чи обох із двох наявних осей, одна з яких - вісь другого порядку. Найпоширенішою є симетрія D₂. (в) Ікосаедрична симетрія. Для суміщення всіх 20 трикутних граней ікосаедра його необхідно обертати навколо однієї або кількох із трьох окремих осей - другого, третього і п'ятого порядку. Справа наведено вигляд з торця кожної з цих осей.

(а) Два типи циклічної симетрії Другого порядку Третього порядку

(б) Два типи діедричної симетрії Другого порядку-3 рази (D2) Другого порядку -2 рази , Четвертого порядку (D4)

(в) Ікосаедрична симетрія П’ятого порядку Третього порядку Другого порядку

РИС. 4-25 Вірусні капсиди. (а) Поліовірус (отримано з PDB ID 2PLV). Протеїни оболонки поліовіруса об'єднані в ікосаедр діаметром 300 Å. Ікосаедрична симетрія є одним із типів обертової симетрії (див. Рис. 4-24в). Зліва наведено зображення контура поверхні поліовірусної капсиди. На зображення справа накладено лінії, що підкреслюють положення осей симетрії. (б) Вірус тютюнової мозаїки (отримано з PDB ID 1VTM). Цей вірус має форму палочки (як видно з електронної мікрофотографії) завдовжки 3 000 Å і з діаметром 180 Å; для нього характерна спіральна симетрія.

РНК Субодиниця протеїну

РИС. 4-26 Денатурація протеїнів. Наведено результати денатурації протеїнів під дією двох факторів. В обох випадках перехід зі згорненого до незгорненого стану відбувається досить різко, що свідчить про кооперативність процесу розгортання. (а) Теплова денатурація апоміоґлобіна коня (міоґлобіна без простетичної гемогрупи ) і рибонуклеази А (що містить інтактні дисульфідні зв'язки, див. Рис. 4-27). Середня точка інтервалу температури, в якому відбувається денатурація, називається температурою плавлення, або T_m. Денатурація апоміоґлобіну відслідковувалася методом циркулярного дихроїзму, який вимірює вміст спіральних структур в макромолекулі. Денатурацію рибонуклеази А простежували за зміною власної флюоресценції протеїну, на яку впливають зміни в оточенні залишків Trp. (б) Денатурація рибонуклеази А (з дисульфідними зв'язками) під дією ґуанідингідрохлориду (GdnHCl), визначена методом циркулярного дихроїзму.

(а) Процент від максимального сигналу Температура Рибонуклеаза А Апоміоглобін

(б) Процент розгорненого протеїну Рибонуклеаза А

РИС. 4-27 Ренатурація розгорненої, денатурованої молекули рибонуклеази. Для денатурації рибонуклеази використовують сечовину і меркаптоетанол (НОСН₂СН₂SH), який відновлює (а, отже, розщеплює) дисульфідні зв'язки з утворенням восьми залишків Cys. У разі ренатурації відбувається поновлення поперечних дисульфідних зв'язків у вихідних положеннях.

Нативний, каталітично активний стан.

додавання сечовини і меркаптоетанолу

Розгорнений стан, неактивний. Дисульфідні поперечні зв'язки відновлені з утворенням залишків Cys.

видалення сечовини й меркаптоетанолу

Нативний, каталітично активний стан. Дисульфідні поперечні зв'язки поновлено

РИС. 4-28 Моделювання процесу згортання протеїну. За допомогою комп'ютера було змодельовано процес згортання фраґмента протеїну віліну (актин-зв'язувальний протеїн, міститься переважно у мікроворсинках кишкового епітелію), що складається із 36 амінокислотних залишків. Вихідні дані - хаотично спіралізований пептид, оточений 3000 молекул води у вигляді можливої "водної оболонки". Для виділення найбільш ймовірних підходів з метою встановлення остаточної структури, із нескінченно великого числа інших можливостей враховувалися молекулярні рухи пептиду і вплив молекул води. Модель дозволила теоретично оцінити час згортання протеїну як величину порядка 1 мс; проте для обчислення необхідних півмільярда інтеґраційних етапів знадобилося два місяці роботи на двох Cray-суперкомп'ютерах.

РИС. 4-29 Термодинаміка згортання протеїнів, зображена у вигляді вільноенерґетичної лійки. У верхній частині лійки число можливих конформацій, а отже і конформаційна ентропія, високі. Тут наявна лише незначна частина внутрішньомолекулярних взаємодій, характерних для нативної конформації. У ході згортання переміщення термодинамічнм шляхом вниз по лійці зменшує число можливих конформацій (зменшуючи ентропію), при цьому зростає частка протеїну у нативній конформації і зменшується вільна енерґія. Заглиблення на стінках лійки відповідають напівстабільним проміжним станам згортання, які в певних випадках можуть сповільнити весь процес.

Початок утворення спіралі і колапс Ентропія Стани розплавленої ґлобули Окремі проміжні стани згортання Нативна структура

Енергія Процент протеїну у нативній конформації

РИС. 4-30 Роль шаперонів у згортанні протеїнів. Циклічний процес, впродовж якого шаперони зв'язують і вивільняють поліпептиди, проілюстровано на прикладі шаперонових протеїнів E. coli DnaK і DnaJ, що є гомологами еукаріотичних шаперонів Hsp70 і Hsp40. Шаперони помітним чином не прискорюють згортання протеїнів, вони лише перешкоджають агрегації незгорнених пептидів. Після проходження циклу певна частина популяції пептидів набуває нативної конформації. Інші знову зв'язуються з DnaK або спрямовуються до системи шаперонінів (GroEl; див. Рис. 4-31). У бактерій в кінці циклу (етап 3) протеїн GrpE тимчасово взаємодіє з DnaK, сприяючи вивільненню ADP і, можливо, DnaJ. У клітинах еукаріотів не виявлено аналоґів GroEl.

Сектор1, знизу: Незгорнений протеїн

DnaJ зв'язується із незгорненим чи частково згорненим протеїном, а пізніше - з DnaK

2. DnaJ стимулює гідроліз ATP під дією DnaK. Комплекс DnaK-ADP міцно зв'язується з незгорненим протеїном

3. У бактерій нуклеотид-обмінний фактор GrpE стимулює вивільнення ADP 4. ATP зв'язується з DnaK і протеїн відділяється

Згорнений протеїн (нативна конформація) До системи GroEL Частково згорнений протеїн

РИС. 4-31 Роль шаперонінів у згортанні протеїнів. (а) Пропонований механізм дії шаперонінів клітин E. Coli - GroEL (належить до родини протеїнів Hsp60) і GroES. Кожен GroEL-комплекс складається із двох великих «кишень», утворених двома гептамерними кільцями (M_r кожної з субодиниць складає 57 000). GroES, також гептамер (M_r кожної субодиниці - 10 000), блокує одну з «кишень» у складі GroEL. (б) Зображення поверхні і зрізу комплексу GroEL/GroES (отримано з PDB ID 1AON). На зрізі (справа) видно велику внутрішню порожнину, всередині якої зв'язані інші протеїни.

1. Незгорнений протеїн зв'язується з «кишенею» GroEL, не заблокованою GroES.

Незгорнений протеїн

2. ATP зв'язується з кожною субодиницею гептамера GroEL.

3. Гідроліз ATP призводить до виділення 14 ADP і GroES.

4. 7 ATP і GroES зв'язуються із GroEL, «кишеня» якого заповнена.

5. Протеїн згортається всередині порожнини.

6. Вивільнений протеїн перебуває в повністю, або частково згорненому стані, здатному набути природної конформації. Згорнений протеїн

7. Вивільнені незгорнені протеїни знову швидко зв'язуються з комплексом