Уровни организации белка.

-Первичная структура белка - это последовательность ковалентно связанных пептидными связями аминокислот, составляющих белок. Пептидная связь.

-Под вторичной структурой белка подразумевают конфигурацию полипептидной цепи, т.е. способ свертывания, скручивания полипептидной цепи в спиральную или какую –либо другую конформацию.

Подробно изучены две основные конфигурации полипептидных цепей, отвечающих структурным требованиям и экспериментальным данным: α-спирали и β-структуры.

наиболее вероятным типом строения глобулярных белков принято считать α-спираль.Закручивание полипептидной цепи происходит по часовой стрелке (правый ход

спирали), что обусловлено L-аминокислотным составом природных белков.

Движущей силой в возникновении α-спиралей (так же как и β-структур)

является способность аминокислот к образованию водородных связей.

Другой тип конфигурации полипептидных цепей, обнаруженный в бел-

ках волос, шелка, мышц и в других фибриллярных белках, получил

название β-структуры. В этом случае две или более линейные полипеп-

тидные цепи, расположенные параллельно или, чаще, антипараллельно,

прочно связываются межцепочечными водородными связями между NH-

и СО-группами соседних цепей, образуя структуру типа складчатого слоя

Таким образом, стабильность вторичной структуры обеспечивается в основном водородными связями (определенный вклад вносят и главновалентные связи – пептидные и дисульфидные).

-Под третичной структурой белка подразумевают пространственную ориентацию полипептидной спирали или способ укладки полипептидной цепи в определенном объеме.

В настоящее время получены бесспорные доказательства, что в стабили-зации пространственной структуры белков, помимо ковалентных связей (пептидные и дисульфидные связи), основную роль играют так называемые нековалентные связи (рис. 1.22). К этим связям относятся водородные связи, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, взаимодействия неполярных боковых радикалов аминокислот, так называемые гидрофобные взаимодействия и т.д.

-Под четвертичной структурой подразумевают способ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или разной) первичной, вторичной или третичной структурой, и формирование единого в структурном и функциональном отношениях макромолекулярного образования.

Связи те же, кроме дисульфидной.

Уровни организации нуклеиновых кислот.

ДНК

1 Первичная структура ДНК - порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинукпеотидной цепи. связь между мономерами обозначают 3', 5'-фосфодиэфирной.

2.Вторичная структура ДНК - молекула ДНК имеет форму спирали, образованную двумя полинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Двойная спираль правозакрученная, полинуклеотидньхе цепи в ней антипараллельны

Полинуклеотидные цепи удерживаются относительно друг друга за счёт водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями А и Т (две связи) и между G и С (три связи) Между основаниями двухцепочечной молекулы в стопке возникают гидрофобные взаимодействия, стабилизирующие двойную спираль.

3. Третичная структура ДНК (суперспирализация ДНК) - каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому.

РНК

1.Первичная структура РНК - порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (НМФ) в полинуклеотидной цепи. нуклеотиды связаны между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями.

2.Вторичная структура РНК - Молекула рибонуклеиновой кислоты построена из одной полинуклеотидной цепи. Отдельные участки цепи РНК образуют спирализованные петли - "шпильки", за счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями A-U и G-C.

Растворимость.

В жидкой воде возникают упорядоченные скопления молекул – кластеры. В структуру кластеров могут встраиваться только такие молекулы, которые сами полярны.Именно полярные вещества хорошо растворимы в воде, т. Е. обладают свойством гидрофильности. Напротив, гидрофобность присуща тем органическим молекулам, которые неполярны.

Полярными являются все те молекулы или фрагменты молекул, в которых есть электроотрицательные атомы. Обладая полярностью, аминокислоты , а следовательно и белки гидрофильны. Аминоислотам это качество присуще уже хотя бы в силу высокой полярности их стандартного фрагмента молекулы, содержащего два атома кислорода и один атом азота. Однако есть и такие аминокислоты, у которых радикал построен только из атомов углерода и водорода. Это делает молекулу амфифильной.

Растворимость. Поскольку молекула белка содержит полярные амино – и карбоксильные группы, то в растворе поверхностные остатки АК гидратируются – происходит образование коацервата.

ФАКТОРЫ СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКА В РАСТВОРЕ

ГИДРАТНАЯ ОБОЛОЧКА - это слой молекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности белковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи молекул воды притягиваются к ней своими положительно заряженными полюсами (смотрите рисунок).

Чем больше гидрофильных свойств у белковой молекулы, чем больше в ее составе и на ее поверхности аминокислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. Вода гидратной оболочки обладает особыми свойствами: она не является свободной, а связана с белковой молекулой. Это - “связанная” вода. Она принадлежит белку, и поэтому имеет особые свойства.

Свойства воды гидратной оболочки

а) Температура кипения выше 1000С.

б) Температура замерзания ниже 0ОС.

в) В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества.

г) Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок.

2) ЗАРЯД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ. Поверхность большинства белковых молекул заряжена потому, что в каждой молекуле белка есть свободные заряженные СОО- и NH3+ группы. Изоэлектрическая точка (ИЭТ) большинства белков организма находится в слабокислой среде. Это означает, что у таких белков количество кислотных (СООН) групп больше количества основных групп (NH3). рН плазмы крови около 7,36 - это выше ИЭТ большинства белков, поэтому в плазме крови белки имеют отрицательный заряд.

Качественные реакции на ароматические аминокислоты:

Реакция Миллона – реакция обусловлена присутствием в белках тирозинового остатка.

Ксантопротеиновая реакция ( Мульдера) – реакция обусловлена наличием в белке циклических аминокислот – тирозина и триптофана, содержащих в своем составе бензольное ядро.

Реакция Адамкевича – реакция обусловлена присутствием в белке остатков аминокислоты триптофана.

Качественная реакция на альфа-аминокислоты:

Нингидриновая реакция – реакция обусловлена наличием в белке остатков альфа-аминокислот.

Принцип метода отделения альбуминов от глобулинов в сыворотке крови.

Одним из методов выделения альбуминов и глобулино из растворов является высаливание. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация солей, что зависит от ионной силы осадителя и размера белковой молекулы. Так, глобулины выпадают из раствора при полунасыщении(50%) сернокислым аммонием в отличие от альбуминов, которые высаливаются при полном насыщении данной солью. Это связано с те, что у глобулинов больше молекулярная масса, чем у альбуминов.

При высаливании поваренной солью и сернокислым магнием глобулины осаждаются при полном насыщении этими солями. Альбумины высаливаются при такой же концентрации поваренной соли и сернокислого магния как и глобулины, но в отличие от глобулинов осадок альбуминов выпадает только при подкислении раствора.

Качественная реакция на серусодержащие аминокислоты

Реакция Фоля - реакция обусловлена присутствием в белке аминокислот цистин и цистеина, содержащих слабосвязанную серу.

Качественная реакция на пептидную связь.

Биуретовая реакция – реакция обусловлена наличием в белках пептидных связей, соединяющих остатки аминокислот.

Качественная реакция на фосфорную кислоту.

Фосфорную кислоту открывают молибденовой пробой и пробой с магнезиальной смесью.

Физико-химические свойства белков.

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются

высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набу-

ханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электри-

ческом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давле-

ние, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство,

обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, использует-

ся для количественного определения белков).

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных

NH2- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований

В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных

аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положитель-

ный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при

очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Раст-

воры белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость

и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию

в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд

характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе

количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект

используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологи-

ческих объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупрони-

цаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также

биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических

поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского-

Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и по-

следние появляются в моче.

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых

входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных

в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется

от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества

отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры

белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их мол.

масса варьирует в широких пределах – от 6000 до 100000 и более.

О величине и форме белковых молекул раньше судили по данным ультра-

центрифугирования, двойного лучепреломления и диффузии. Эти данные

указывали на существование в природе глобулярных (шарообразных) и

фибриллярных (нитевидных) белков.

Денатурация белков

Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной прост-

ранственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-хими-

ческих и биологических свойств при физиологических значениях темпера-

туры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических

факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя

нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать

нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка,

преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характер-

ных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность,

биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при

нагревании их растворов выше 50–60°С.

Изоэлектрическая и изоионная точки белков

В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотер-

ными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом

поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить

изоэлектрическую точку (pI); pI является характерной константой белков

В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко

выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени

зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее

величину не влияет концентрация белка.

Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов,

образующихся при диссоциации воды.

Правило Чаргаффа

Азотистые основания ДНК обычно варьируют у разных видов организмов, однако почти не претерпевают изменений у одного и того же вида в процессе развития или в зависимости от изменений окружающей среды либо характера питания. Показано также, что ДНК, выделенная из разных тканей одного и того же вида, имеет одинаковый состав азотистых оснований. Полученные количественные соотношения были названы правилами Чаргаффа.

1) молярная доля пуринов * равна молярной доле пиримидинов:

2) количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и тимина:

3) количество аденина равно количеству тимина, а количество гуанина

равно количеству цитозина: А = Т и Г = Ц; соответственно

4) существенным для характеристики вида (таксономическое значение)

оказался так называемый коэффициент специфичности, отражающий от-

ношение

электрофоретическая подвжность.

Посредством изменения рН можно регулировать электрофоретическую подвижность белка. Если pi данного белка меньше рН среды, то его заряд и скорость будут отрицательными. Напротив, белки с pi > рН будут двигаться в положительном направлении. Этот принцип положен в основу одного из методов определения pi белков и других веществ; в градиенте рН р! белка равна рН, при котором его электрофоретическая подвижность Ue равна нулю.

Классификация белков по строению.

1.Простые белки.

-протамины

-гистоны

-альбумины

-глобулины

-проламины

-глютелины

2.Сложные белки

-фосфопротеины

-хромопротеины

-нуклеопротеины

-гликопротеины

-липопротеины

-металлопротеины

Характеристика простых белков.

Простые белки - построены из остатков аминокислот и при гидролизе

распадаются соответственно только на свободные аминокислоты.

Протамины и гистоны. Данная группа белков отличается рядом характер-

ных физико-химических свойств, своеобразием аминокислотного состава

и представлена в основном белками с небольшой молекулярной массой.

Протамины обладают выраженными основными свойствами, обусловленными наличием в их составе от 60 до 85% аргинина. Протамины хорошо растворимы в воде, изоэлектрическая точка их

водных растворов находится в щелочной среде.

Гистоны также являются белками основного характера. В их состав

входят лизин и аргинин, содержание которых, однако, не превышает

20–30%. Молекулярная масса гистонов намного больше нижнего предела

молекулярной массы белков.

Проламины и глютелины. Это белки растительного происхождения,

отличаются своеобразием аминокислотного состава и физико-химических

свойств. Характерной особен-

ностью проламинов является растворимость в 60–80% водном растворе

этанола, в то время как все остальные простые белки в этих условиях

обычно выпадают в осадок. Установлено, что проламины содержат 20–25% глутаминовой кислоты

и 10–15% пролина.

Альбумины и глобулины. Эти белки относятся к белкам, широко рас-

пространенным в органах и тканях животных. Альбумины и глобулины – это

глобулярные белки, различающиеся по растворимости Альбумины и глобулины отличаются

друг от друга также по молекулярной массе – соответственно 40000–70000

и 150000 и более. Альбумин имеет относительно низкую

изоэлектрическую точку (4,7) и высокий отрицательный заряд при рН 8,6,

благодаря чему он мигрирует с большой скоростью в электрическом поле

к аноду.

Методы выделения и очистки белков.

Гомогенизация биологического материала

Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани

животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно

измельчают до гомогенного состояния, Для

выделения ряда белков из плотных животных и растительных объектов

часто используют валковые или шаровые мельницы

Экстракция белков

Современные методы измельчения тканей обычно сочетают с одновремен-

ной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей

хорошо растворимо в 8–10% растворах солей. При экстракции белков

широко применяют различные буферные смеси с определенными значения-

ми рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты –

вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками

и липидами и между белковыми молекулами. Для получения из биологического материала белков в чистом, гомо-

генном, состоянии применяют различные детергенты, способствующие

расщеплению белок-липидных комплексов и разрыву белок-белковых свя-

зей *. Следует, однако, иметь в виду, что детергенты, вызывая разрыв белок-

белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру бел-

ков.