3.4 Пример расчета

На титрование 1 см³ опытной пробы пошло 1,08 см³ 0,1 Н раствора NaOH, а на титрование 1 см³ контрольной пробы – 0,68 см³. Время ферментолиза было 3 ч. Поправка к титру NaOH Следовательно, мг.

Исходная 10 %-ная вытяжка была приготовлена из сырой поверхностной культуры с влажностью 50 %, фильтрат вытяжки из культуры в количестве 2 см³ был добавлен к 10 см³ 5 %-ного раствора желатина, из реакционной смеси на анализ отобрали 1 см³. Схема разведения имеет вид:

Подсчитываем ПС:

ед. на 1 г культуры.

Если требуется пересчитать протеолитическую активность на сухое вещество культуры (ед./г), то расчёт ведётся по формуле:

.

Если ведётся определение активности в очищенном препарате, то составляется соответствующая схема разведения и делается аналогичный расчёт.

Приложение а Приготовление реактивов

А.1 Приготовление буферных растворов

Буферные растворы готовятся в соответствии с межгосударственным стандартом (ГОСТ 4919.2-77, СТ СЭВ 808-77).

Для приготовления буферных растворов используют дистиллированную воду, не содержащую углекислоты (дистиллированную воду кипятят в течение 20 мин, охлаждают и хранят в стеклянных бутылях, защищенных от диоксида углерода при помощи вставленных в резиновые пробки хлоркальциевых трубок, заполненных натронной известью).

Навески препаратов взвешивают с погрешностью не более 0,001 г. Для приготовления исходных растворов применяют калиброванные мерные колбы.

Исходные растворы после тщательного перемешивания переносят в сухие склянки с хорошо притертыми пробками.

Исходные растворы для приготовления буферных растворов отмеривают при 18…22 ºС при помощи бюреток высшего класса точности.

Исходные растворы хранят при комнатной температуре в местах, защищенных от попадания прямых солнечных лучей не более двух месяцев. При наличии в растворе помутнения и хлопьевидного осадка раствор следует заменить свежеприготовленным.

Рабочие буферные растворы хранению не подлежат.

При необходимости проверки рН какого-либо раствора, его измеряют на рН-метре, предварительно проверенном и откалиброванном по образцовым буферным растворам. Измеренное значение рН для рабочих буферных растворов должно отличаться от величин, указанных в таблицах не более чем на 0,1 рН.

А.1.1 Приготовление ацетатного буферного раствора

Для приготовления ацетатного буферного раствора используют следующие реактивы.

Кислота уксусная, 99…100 %-ная, CH₃COOH, молекулярная масса 60,05. Не требует предварительной подготовки.

Натрий уксуснокислый, CH₃COONa·3H₂O, молекулярная масса 136,08. Не требует предварительной подготовки.

Для приготовления исходного 0,2 М раствора уксусной кислоты 12,010 г препарата растворяют в воде и объем раствора доводят водой до 1 л.

Для приготовления исходного 0,2 М раствора уксуснокислого натрия 27,216 г препарата CH₃COONa·3H₂O растворяют в воде и объем раствора доводят водой до 1 л.

Из исходных растворов готовят ацетатные буферные растворы с рН от 2,8 до 6,0 в соответствии с таблицей А.1.

Таблица А.1. – Ацетатный буферный раствор с рН 2,8…6,0

рН	0,2 М раствор уксусной кислоты, мл	0,2 М раствор уксуснокислого натрия, мл
2,8	100,0	–
3,0	98,0	2,0
3,2	97,0	3,0
3,4	94,5	5,5
3,6	92,5	7,5
3,8	88,0	12,0
4,0	82,0	18,0
4,2	73,5	26,5
4,4	63,0	37,0
4,6	51,0	49,0
4,8	40,0	60,0
5,0	29,5	70,5
5,2	21,0	79,0
5,4	14,5	85,5
5,6	9,5	90,5
5,8	7,0	93,0
6,0	5,0	95,0

А.1.2 Приготовление фосфатного буферного раствора

Для приготовления буферных растворов применяют реактивы квалификации х.ч. и ч.д.а., специально подготовленные. Подготовка реактивов проводится следующим образом.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, KH₂PO₄, молекулярная масса 136,09. 100 г препарата растворяют при нагревании до кипения в 150 мл воды. Раствор фильтруют горячим. При постоянном перемешивании фильтрат охлаждают до 10 ºС. Затем добавляют 150 мл этилового спирта. Выделившиеся при постоянном перемешивании фильтрата кристаллы отфильтровывают на отсасывающей воронке и снова перекристаллизовавают в тех же условиях; кристаллы сушат до постоянной массы при 105…110 ºС. При наличии препарата с содержанием основного вещества в пределах 99,9…100,0 % предварительная подготовка вещества не проводится.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, Na₂HPO₄·12H₂O, молекулярная масса 358,12. Существует два способа подготовки препарата.

а) 150 г препарата растворяют в 150 мл воды при нагревании до 100⁰С. Раствор фильтруют горячим и после охлаждения отфильтровывают выпавшие кристаллы. Перекристализацию повторяют при нагревании до 100 ºС. Перекристаллизованный препарат нагревают в фарфоровой чашке на водяной бане при непрерывном перемешивании до полного высыхания препарата. Полученную соль высушивают в эксикаторе над плавленым хлористым кальцием в течение суток. В перекристаллизованном препарате (Na₂HPO₄·2H₂O) проверяют содержание основного вещества. Для этого около 0,5000 г препарата растворяют в 50 мл воды, прибавляют 2…3 мл насыщенного раствора хлористого натрия и титруют 0,1 н раствором соляной кислоты в присутствии индикатора метилового красного. При необходимости вносят поправку в величину навески. 1 мл точно 0,1 н раствора соляной кислоты соответствует 0,0178 г Na₂HPO₄·2H₂O.

б) 75 г препарата растворяют в 250 мл воды, нагретой до 60 ºС. Раствор фильтруют горячим, фильтрат охлаждают при постоянном перемешивании до 10 ºС. Выпавшие кристаллы отфильтровывают на отсасывающей воронке и снова перекристаллизовывают в тех же условиях. Полученную соль сначала высушивают при температуре не выше 30 ºС в течение 24 ч, затем продолжают высушивать в сушильном шкафу при 50 ºС в течение 3…4 ч, и, наконец, при 120±5 ºС до постоянной массы, не допуская расплавления соли. После высушивания соль имеет состав Na₂HPO₄.

После подготовки реактивов готовят исходные растворы калия фосфорнокислого однозамещенного и натрия фосфорнокислого двузамещенного.

Навеску безводного калия фосфорнокислого однозамещенного KH₂PO₄ массой 9,078 г растворяют в воде и объем раствора доводят до 1 л. Для стабилизации раствора добавляют 3…4 капли толуола.

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного Na₂HPO₄·12H₂O, массой 11,876 г растворяют в воде и объем раствора доводят до 1 л. Для стабилизации раствора добавляют 3…4 капли толуола.

Из исходных растворов готовят фосфатные буферные растворы с рН от 4,94 до 9,18 в соответствии с таблицей А.2.

Таблица А.2 – Фосфатный буферный раствор с рН 4,94…9,18

рН	раствор Na2HPO4·12H2O, мл	раствор KH2PO4, мл
4,94	1,0	99,0
5,29	2,5	97,5
5,59	5,0	95,0
5,91	10,0	90,0
6,24	20,0	80,0
6,47	30,0	70,0
6,64	40,0	60,0
6,81	50,0	50,0
6,98	60,0	40,0
7,17	70,0	30,0
7,38	80,0	20,0
7,73	90,0	10,0
8,04	95,0	5,0
8,34	97,5	2,5
8,67	99,0	1,0
9,18	100,0	0,0

А.2 Приготовление 0,1 н раствора гидроксида натрия

Все растворы гидроксида натрия хранят в полиэтиленовых флаконах или в склянках, покрытых парафином, или в склянках, защищенных от диоксида углерода при помощи вставленных в резиновые пробки хлоркальциевых трубок, заполненных натронной известью.

Сначала готовят насыщенный раствор щелочи. Если имеющийся в лаборатории гидроксид натрия частично покрыт слоем карбоната натрия, то перед растворением кусочки гидроксида натрия быстро обмывают водой. В фарфоровом стакане в 250 мл воды растворяют 250 г гидроксида натрия. Щелочь добавляют постепенно при перемешивании, чтобы избежать местного перегрева и образования труднорастворимого осадка.

После охлаждения раствор переливают в подготовленную посуду и выдерживают течение 15…20 суток до полного выпадения осадка углекислого натрия, нерастворимого в растворе гидроокиси натрия указанной концентрации. В отстоявшемся прозрачном растворе устанавливают содержание гидроокиси натрия титрованием, для чего 1 мл раствора разбавляют водой до 50 мл и титруют 1 н раствором кислоты (серной или соляной) в присутствии 1 капли индикатора метилового оранжевого.1 мл точно 1 н раствора кислоты соответствует 0,04 г NaOH.

1 н; 0,2 н и 0,1 н растворы готовят соответствующим разбавлением объемов концентрированного раствора гидроокиси натрия, содержащих соответственно 40,0; 8,0 и 4,0 г NaOH.

Отмеренный объем раствора доводят водой до 1 л. Коэффициент поправки устанавливают титрованием кислотой соответствующей нормальности по метиловому оранжевому. 1 н раствор хранят в полиэтиленовом флаконе.

Для точной установки титра 0,1 н раствора NaOH по титрованному раствору HCl следует из бюретки отобрать в конические колбы вместимостью 250 см³ 3…4 параллельные пробы по 35…30 мл 0,1 н раствора NaOH. В каждую колбу вносят 3…4 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н раствором HCl до исчезновения розовой окраски. Затем добавляют 1…2 капли метилового оранжевого и продолжают титрование до перехода желтого окрашивания в оранжево-желтое.

Расчет для определения коэффициента поправки щелочи по соляной кислоте:

по фенолфталеину ,

по метиловому оранжевому ,

где V– объем 0,1 н раствора NaOH, взятый на титрование, см³;

V₁ – объем 0,1 н раствора HC, израсходованное на титрование с фенолфтелеином, см³;

V₂ – объем 0,1 н раствора HC, израсходованное на титрование с метиловым оранжевым, см³.

Расхождение между коэффициентами поправки щелочи, установленными по метиловому оранжевому и по фенолфталеину, свидетельствует о загрязненности щелочи карбонатами. Максимально допустимое расхождение 0,4 %.

Если приготовленный раствор щелочи будет использоваться для титрования кислот, то в 3…4 конические колбы вносят по 25…30 мл 0,1 н раствора HCl и титруют 0,1 н раствором NaOH в присутствии фенолфталеина с кипячением и повторным титрованием до неисчезающей в течение 1 минуты светло-розовой окраски. Такой коэффициент совпадает с коэффициентом, установленным по метиловому оранжевому и по исходному веществу в пределах допустимой ошибки. Бюретку, используемую для титрования щелочью, не следует использовать для титрования кислотой.

При отсутствии резких колебаний температур титр щелочей необходимо проверять не реже 1 раза в 3 месяца.

Концентрацию раствора можно также установить по его плотности в соответствии с таблицей А.3.

Таблица А.3 – Зависимость между плотностью раствора NaOH

и его концентрацией при температуре 20 ºС

Плотность раствора, г/см3	Концентрация раствора NaOH,
	%	моль/л	г/л
1	2	3	4
1,000	0,159	0,0398	1,59
1,0005	0,602	0,151	6,04
1,010	1,04	0,264	10,56
1,015	1,49	0,378	15,12
1,020	1,94	0,494	19,76
1,025	2,39	0,611	24,44
1,030	2,84	0,731	29,24
1,035	3,29	0,851	34,04
1,040	3,74	0,971	38,84
1,045	4,20	1,097	43,88
1,050	4,65	1,222	48,88
1,055	5,11	1,347	53,88
1,060	5,56	1,474	58,96
1,065	6,02	1,602	64,08
1,070	6,47	1,731	69,24
1,075	6,93	1,862	74,48
1,080	7,38	1,992	79,68
1,085	7,83	2,123	84,92
1,090	8,28	2,257	90,28
1,095	8,74	2,391	95,64
1,100	9,19	2,527	101,1
1,105	9,64	2,664	106,6
1,110	10,10	2,802	112,1
1,115	10,55	2,942	117,7
1,120	11,01	3,082	123,3
1,125	11,46	3,224	129,0
1,130	11,92	3,367	134,7
1,135	12,37	3,510	140,4
1,140	12,83	3,655	146,2
1,145	13,28	3,801	152,0
1,150	13,73	3,947	157,9
1,155	14,18	4,095	163,8
1,160	14,64	4,244	169,8
1,165	15,09	4,395	175,8

Продолжение таблицы А.3

1	2	3	4
1,170	15,54	4,545	181,8
1,175	15,99	4,697	187,9
1,180	16,44	4,850	194,0
1,185	16,89	5,004	200,2
1,190	17,34	5,160	206,4
1,195	17,80	5,317	212,7
1,200	18,25	5,476	219,0
1,205	18,71	5,636	225,4
1,210	19,16	5,796	231,8
1,215	19,62	5,958	238,3
1,220	20,07	6,122	244,9
1,225	20,53	6,286	251,4
1,230	20,98	6,451	258,0
1,235	21,44	6,619	264,8
1,240	21,90	6,788	271,5
1,245	22,36	6,958	278,3
1,250	22,82	7,129	285,2
1,255	23,27	7,302	292,1
1,260	23,73	7,475	299,0
1,265	24,19	7,650	306,0
1,270	24,64	7,824	313,0
1,275	25,10	8,000	320,0
1,280	25,56	8,178	327,1
1,285	26,02	8,387	334,3
1,290	26,48	8,539	341,6
1,295	26,94	8,722	348,9
1,300	27,41	8,906	356,2
1,305	27,87	9,092	363,7
1,310	28,33	9,278	371,1
1,315	28,80	9,466	378,6
1,320	29,26	9,656	386,2
1,325	29,73	9,847	393,9
1,330	30,20	10,04	401,6
1,335	30,67	10,23	409,2
1,340	31,14	10,43	417,2
1,345	31,62	10,63	425,2
1,350	32,10	10,83	433,2
1,355	32,58	11,03	441,2
1,360	33,06	11,24	449,6
1,365	33,54	11,45	458,0
1,370	34,03	11,65	466,0
1,375	34,52	11,86	474,4
1,380	35,01	12,08	483,2
1,385	35,50	12,29	491,6
1,390	36,00	12,51	500,4

Продолжение таблицы А.3

1	2	3	4
1,395	36,49	12,73	509,2
1,400	36,99	12,95	518,0
1,405	37,49	13,17	526,8
1,410	37,99	13,39	535,6
1,415	38,49	13,61	544,4
1,420	38,99	13,84	553,6
1,425	39,49	14,07	562,8
1,430	40,00	14,30	572,0
1,435	40,51	14,53	581,2
1,440	41,03	14,77	590,8
1,445	41,55	15,01	600,4
1,450	42,07	15,25	610,0
1,455	42,59	15,49	619,6
1,460	43,12	15,74	629,6
1,465	43,64	15,98	639,2
1,470	44,17	16,23	649,2
1,475	44,69	16,48	659,2
1,480	45,22	16,73	669,2
1,485	45,75	16,98	679,2
1,490	46,27	17,23	689,2
1,495	46,80	17,49	699,6
1,500	47,33	17,75	710,0
1,505	47,85	18,00	720,0
1,510	48,38	18,26	730,4
1,515	48,90	18,52	740,8
1,520	49,44	18,78	751,2
1,525	49,97	19,05	762,0
1,530	50,50	19,31	772,4

А.3 Приготовление растворов индикаторов

Растворы готовят из индикаторов, тонкорастертых в агатовой или фарфоровой ступке.

Метиловый оранжевый

В интервале рН 3,0…4,4 ед. рН окраска изменяется от красной к желтой.

0,1 г препарата растворяют в 80 мл горячей воды и по охлаждении доводят объем раствора водой до 100 мл.

Фенолфталеин

В интервале рН 8,2…10,0 окраска изменяется от бесцветной к красно-фиолетовой.

1 г препарата растворяют в 80 мл этилового спирта и доводят объем раствора водой до 100 мл.