Глава VIII Генна інженерія рослин
8.1. Сутність генної інженерії рослин
Генно-інженерні методи, зокрема технологія рекомбінантних ДНК, дозволяє створювати нові генотипи та, отже, нові форми рослин набагато швидше, ніж класичні методи селекції. Крім того, з’являється можливість цілеспрямованої зміни генотипу – трансформації – завдяки введенню визначених генів.
Проблеми вирощування сільськогосподарських рослин пов’язані з перспективою введення в них генів стійкості до стресових факторів, фітопатогенам, пестицидам, генів скороспілості, а також з розширенням кола культурних рослин, здібних до симбіотичної фіксації азоту.
Генетична трансформація, головним чином, полягає у перенесенні інорідних або модифікованих генів в еукаріотичні клітини. Можна вводити гени в клітини прокаріот, але це перенесення здійснюється не для трансформації, а з метою збільшення експресії інорідних генів, їх клонування. У клітинах рослин також можлива експресія генів, перенесених не тільки від інших рослин, а й від мікроорганізмів та навіть від тварин.
Отримання рослин з новими властивостями з трансформованих клітин (регенерація) можливе завдяки їх властивості тотипотентності, тобто властивості розвиватися в цілу рослину.
Однак можливості генної інженерії рослин обмежуються рядом причин. По-перше, геном рослин вивчений гірше, ніж геном ссавців. Це означає, що визначення та виділення потрібних генів – задача дуже складна. По-друге, не для всіх рослин вдається підібрати умови регенерації. Стабільно отримують рослини-регенеранти з протопластів картоплі, люцерни, томатів, моркви, тютюну, капусти та ін. Регенерацію злаків з їх клітин поки не завжди вдається відтворити. Нарешті одна з головних лімітуючих причин – розмір гетерологічної ДНК (не більше 35 кб для агробактеріальної та балістичної трансформації), яку можна було б ефективно вводити в геном рослини. Не так давно була зроблена вдала спроба використати при трансформації пилок в якості супервектора, що дозволяє виключити появу химерних рослин (В. А. Аветисов, Ю. В. Давидова та ін., 1999). Є повідомлення про використання штучної бактеріальної хромосоми в якості вектора для трансформації, котра дозволяє переносити значні фрагменти ДНК, вводити касети генів, що кодують численні ступені біохімічних процесів. Це відкриває такі великі перспективи, що первинними стають питання екологічної безпеки.
Біотехнологія та, зокрема, генна інженерія підійшли до того ступеню розвитку, коли перш за все потрібно думати про можливі наслідки експерименту, про використання отриманих знань.
8.2. Отримання трансгенних рослин
Переніс генів в рослинні клітини, так само як і в клітини тварин, та їх вбудовування в геном рослин ( трансформація ) здійснюються головним чином завдяки специфічним структурам – векторам.
Вектори на основі Ті-плазмід. Деякі види агробактерій ( Agrobacteria ) можуть заражати дводольні рослини, викликаючи утворення пухлин – корончатих галлів. Одним із самих сильних індукторів пухлин є ґрунтова бактерія A. tumefaciens. Здатність цієї бактерії до утворення пухлини пов’язана з великою позахромосомною плазмідою, що отримала назву Ті-плазміда (від англ. tumor inducing – що індукують пухлину). Ті-плазміди – це природні вектори для генів, які володіють усіма функціями, необхідними для переносу, стабільного включення та експресії генетичної інформації у рослинах. Вони мають широке коло господарів. У бактеріальних клітинах Ті-плазміди реплікуються автономно. Ці плазміди розрізняються по типу кодованих опинів – білків, котрі використовуються бактеріями в якості джерела азоту та вуглецю. Зазвичай зустрічаються плазміди, які кодують два типи опинів: або октопин ( октопинова плазміда), або нопалин (нопалинова плазміда).
Після зараження частина Ті-плазміди зустрічається у хромосомах клітин рослин-господарів. Отже, A. tumefaciens вбудовує частину свого генома у ДНК рослинної клітини та заставляє її таким чином змінити метаболізм, синтезуючи речовини , необхідні для бактерій. Саме ця властивість A. tumefaciens стала приводом для створення на основі Ті-плазміди вектора, що доставляє необхідні гени в клітину.
Ділянка Ті-плазміди, яка зустрічається у хромосомах рослинних клітин, має назву Т-областю в бактерії та Т-ДНК у клітинах рослин. Т-область включає приблизно 10% Ті-плазміди та містить гени, які відповідають за індукцію пухлини, синтез опинів та придушення диференціювання (гормононезалежний ріст клітин). Важливо відмітити, що всі гени, які відповідають за переніс та інтеграцію генів Т-області, знаходяться не в ній самій, а поряд – в області вірулентності – vir-області (рис. 23).
Т-області обмежені прямими послідовностями, що повторюються, і будь-яка ДНК, встановлена між цими повторами, буде прийнята за Т-область та перенесена у рослинну клітину.
Т-область
vir-область
Мал.1 Вхаємне розміщення Т та
vir-областей в Ті-плазмиді
Недолік цих плазмід у тому, що деякі гени, які знаходяться в Т-ДНК, примушують рости клітини рослин незалежно від гормонів, що вносяться до поживного середовища, на якому культивуються дані клітини. У зв’язку із цим дуже складно регенерувати нормальну рослину з клітин, що містять повну послідовність Т-ДНК. Інший недолік – великі розміри Ті-плазміди, через які утруднені будь-які маніпуляції з нею, тому вставити ген у плазміду традиційними методами неможливо.
В даний час конструюються похідні Ті-плазміди, в яких залишають регулярну ділянку Т-області, а замість її структурованих генів вшивають структурну частину гена, котрий потрібно ввести у рослину. Такі гени з позиції їх регенерації нешкідливі для рослин.
Існують й інші бактерії ( A. rhizogenes ), що викликають посилене утворення корінців при зараженні рослин. За цей процес відповідальні так звані Rі-плазмиди ( від англ. root inducing – корені, що індукують), що містяться в них. Rі-плазміди вигідно відрізняються від Ті-плазмід тим, що вони слугують природними нешкідливими векторами, так як трансформовані з їх допомогою рослинні клітини зберігають здатність до морфогенезу та до регенерації здорових рослин. У зв’язку з цим Rі-плазміди в даний час розглядаються як перспективніші вектори.
Проміжний та бінарний вектори. Ці вектори конструюються на основі Ті-плазмід. Проміжний вектор отримують шляхом складних операцій. Спочатку Т-область за допомогою рестриктаз вирізують з плазмиди, вставляють у вектор для клонування в клітині Е. coli та розмножують. Отриману рекомбінантну плазмиду вводять у клітини A. Tumefaciens, які несуть повну Ті-плазміду. В результаті подвійного косенговера між гомологічними ділянками Т-область рекомбінантної плазміди, яка містить інорідний ген, включається в Ті-плазміду клітини господаря, замістивши в ній нормальну Т-область. Нарешті бактеріями, які мають Ті-плазміду з вбудованими генами, заражають рослини, де ці гени вбудовуються в геном клітини.
Бінарні вектори є бактеріями, які містять дві Ті-плазміди. Одна з них несе vir-область та забезпечує інтегрування в геном рослинної клітини Т-області, що містить будь-які гени іншої плазміди. В цьому випадку подвійний кросенговір не потрібен.
Однак отримані в результаті зараження бактеріями рослинні клітини не здатні до регенерації, так як в них пригнічено диференціювання. Трансформовані рослині клітини зможуть диференціюватися, якщо в гени, які блокують диференціювання, ввести мутації або вирізати їх з Т-ДНК.
Вектори на основі ДНК, що містять віруси рослин. Віруси можна розглядати як різновиди чужорідної нуклеїнової кислоти, котрі реплікуються та експресуються в клітинах рослин. РНК містить переважну більшість фітовірусів в якості носія генетичної інформації. Тільки 1-2 % вірусів, інфікованих рослин, відносяться до ДНК- складових. Саме ці віруси зручні для використання в технології рекомбінантних ДНК, а також в якості векторів.
ДНК-вмісні віруси можуть включати одноланцюгову або дволанцюгову ДНК. В якості представників першої групи можна назвати вірус золотої мозаїки квасолі (ВЗМК) або вірус смугастості кукурудзи. Найбільш вивчений представник групи вірусів з дволанцюгової ДНК – вірус мозаїки кольорової капусти (ВМКК), що вражає в основному рослини родини хрестоцвітних.
Зазвичай фітовіруси реплікуються з утворенням великого числа копій молекул нуклеїнових кислот – 106 та більше молекул на заражену клітину. Наприклад, при реплікації вірусу тютюнової мозаїки утворюється 107 молекул нуклеїнових кислот (РНК) на клітину. Тому фітовіруси є дуже ефективними засобами для отримання доброї експресії чужорідного гену. Окрім високої копійності вірусної нуклеїнової кислоти вірусні векторні системи мають ще ряд переваг: малий розмір геному (можливість легкої маніпуляції вірусної ДНК) та сильні промотори, які забезпечують ефективну експресію чужорідних генів.
Однак віруси в якості векторів мають суттєві недоліки: мають невелику ємність, патогенні та нездатні вбудовуватися у хромосоми господаря. Невелику ємність можна збільшити, якщо інфікувати вірусом (наприклад, ВМКК) рослинні протопласти, а не клітини. В цьому випадку інфекція не передається від клітини до клітини, немає необхідності в упаковці ДНК у вірусні частки.
Отже, частина вірусного геному, яка відповідає за упаковку у вірусні частки, може бути видалена та заміщена додатковою чужорідною ДНК. Другий недолік – відсутність здатності вбудовуватися в геном рослинної клітини – вдається обійти (принаймні ВМКК) завдяки спеціальному методичному заходу – агроінфекції. Для цього геном ВМКК вбудовують в Т-область Ті-плазмиди і в її складі інтегрують в ядерний геном різних рослин.
Методи прямого переносу генів у рослини. Ці методи виникли завдяки появі специфічного об’єкту – ізольованих протопластів, тобто клітин, позбавлених целюлозної стінки.
Методи прямого переносу генів досить чисельні:
Трансформація рослинних протопластів. Здійснюється завдяки комбінації методик кальцієвої преципітації ДНК та злиття протопластів. Для трансформації може бути використаний майже будь-який ДНК-вектор. Донорська ДНК може не містити спеціальних біологічних сигналів (vir-областей, прикордонних областей Т-ДНК).
Культуру протопластів на початковій стадії її росту заражають агробактеріями, котрі використовують в якості векторів.
Мікроін’єкції ДНК. Аналогічний методу мікроін’єкції тваринних клітин. Цей метод можна розглядати як найбільш універсальний. Ефективність трансформації рослинних клітин складає 10-20% незалежно від типу вектора. Трансформація не видоспецифічна , можливий переніс генів в будь-яку рослину.
Електропорація. Метод заснований на підвищенні проникності біомембран за рахунок дії імпульсів високої напруги. В результаті молекули ДНК проникають у клітини крізь шпарини в клітинній мембрані.
Упаковка в ліпосоми. Це один з методів, які дозволяють захистити екзогенний генетичний матеріал від руйнування нуклеазами рослинної клітини. Ліпосоми – сферичні тільця, оболонки яких утворені фосфоліпідами.
Метод біологічної балістики. Це один з най ефективніших методів трансформації одностатевих рослин. Вихідний матеріал для трансформації – суспензійна культура, калусна тканина або 4-5 – денні культивовані незрілі зародки однодольних.
Метод засновано на напилені ДНК-вектора на дрібні частки вольфраму, котрим потім бомбардують клітини. Бомбардування здійснюється за допомогою біолестичної гармати за рахунок перепаду тиску. Частина клітин гине, а ті, які залишилися живими трансформуються, потім їх культивують та використовують для регенерації рослин.