3. Пренатальная диагностика

Пренатальная диагностика — дородовая диагностика с целью обнаружения патологии на стадии внутриутробного развития. Позволяет обнаружить более 90 % плодов с синдромом Дауна (трисомия 21); трисомии 18 (известной как синдром Эдвардса) около 97 %, более 40 % нарушений развития сердца и др. В случае наличия у плода болезни родители при помощи врача-консультанта тщательно взвешивают возможности современной медицины и свои собственные в плане реабилитации ребёнка. В результате семья принимает решение о судьбе данного ребёнка и решает вопрос о продолжении вынашивания или о прерывании беременности.

К пренатальной диагностике относится и определение отцовства на ранних сроках беременности, а также определение пола плода.

Применение предимплантационной диагностики

В настоящее время в ряде стран уже доступна предимплантационная диагностика (до имплантации в матку) эмбриона, развившегося в результате искусственного оплодотворения (при числе клеток около 10). Определяется наличие маркеров около 6000 наследственных заболеваний, после чего решается вопрос о целесообразности имплантации эмбриона в матку. Это позволяет иметь собственного ребёнка парам, ранее не рисковавшим из-за высокого риска наследственных заболеваний. С другой стороны, некоторые специалисты считают, что практика вмешательства в природное разнообразие генов несёт в себе определённые скрытые риски.

Методы пренатальной диагностики

• Анализ родословной родителей

• Генетический анализ для родителей

• Инвазивные (разрушающие) методы пренатальной диагностики

  • Биопсия хориона

  • Плацентоцентез (поздняя биопсия хориона)

  • Амниоцентез

  • Кордоцентез

• Неинвазивные (неразрушающие) методы пренатальной диагностики

  • Скрининг материнских сывороточных факторов

  • Ультразвуковой скрининг плода, оболочек и плаценты

  • Сортинг фетальных клеток

  • Тест Pink or Blue

Биопсия хориона — получение образца ткани хориона с целью выявления и профилактики хромосомных болезней, носительства хромосомных аномалий, а также моногенных болезней. Получение ткани хориона осуществляют путем пункции матки через переднюю брюшную стенку^[1] или через влагалище и шейку матки биопсийными щипцами^[2] или аспирационным катетером^[3]. Выбор метода зависит от особенностей расположения хориона в матке. Ткань хориона, в основном, имеет ту же генетическую структуру, что и плод, поэтому пригодна для проведения генетической диагностики.

Объем тканей хориона, достаточный для генетического ответа — 10 — 15 мг. Частота получения необходимого количества плодного материала: 94 — 99,5 %.

Основное преимущество биопсии хориона — выполнение диагностики в ранние сроки беременности, быстрота получения результата (в среднем 2-3 дня), возможно определение пола плода и ДНК-диагностика заболевания.

Показания

• Возраст беременной 35 лет и старше.

• Отягощенный акушерский и генетический анамнез (наличие в анамнезе рождение ребенка с ВПР,

хромосомной или моногенной болезнью)

• Семейное носительство хромосомной аномалии или генной мутации

• Данные эхографии (в 10-14 недель толщина воротникового пространства > 3 мм)

Сроки проведения

Оптимальные сроки для проведения биопсии хориона — 9.5-12 недель. Манипуляция проводится строго под контролем УЗИ.

Осложнения

• Самопроизвольное прерывание беременности — при трансабдоминальном доступе 0,88 — 2 %, при трансцервикальном — 2 — 14,3 %.

• Кровотечение

• Ретроплацентарная гематома

• Болевые ощущения

• Хориоамнионит

Противопоказания

Лихорадочное состояние женщины, обострение хронических заболеваний, кровянистые выделения из половых путей, миоматозные узлы больших размеров с признаками нарушения питания, выраженная несостоятельность шейки матки, инфекционное поражение кожи передней брюшной стенки, анатомическая недоступность ткани хориона, выраженный спаечный процесс в малом тазу.

Амниоцентез — инвазивная процедура, заключающаяся в пункции амниотической оболочки с целью получения околоплодных вод для последующего лабораторного исследования, амниоредукции или введения в амниотическую полость лекарственных средств. Амниоцентез можно выполнять в первом, втором и третьем триместрах беременности (оптимально — в 16-20 недель беременности).

Классификация амниоцентеза

По времени проведения:

• ранний амниоцентез: выполняют в первом триместре беременности (с 10 по 14-ю недели);

• поздний амниоцентез: выполняют после 15-й недели беременности.

По технике доступа:

• с использованием пункционного адаптера;

• методом «свободной руки».

Показания к амниоцентезу

• Пренатальная диагностика врождённых и наследственных заболеваний. Лабораторная диагностика врождённых и наследственных заболеваний основана на цитогенетическом и молекулярном анализе амниоцитов.

• Амниоредукция (при многоводии).

• Интраамниальное введение препаратов для прерывания беременности во втором триместре.

• Оценка состояния плода во втором и третьем триместрах беременности (степень тяжести гемолитической болезни, зрелость сурфактантов лёгких, диагностика внутриутробных инфекций).

• Фетотерапия.

• Фетохирургия.

Противопоказание к амниоцентезу

Острый процесс или обострение хронического воспаления любой локализации.

Техника амниоцентеза

Под ультразвуковым контролем выбирают место пункции. Пункцию предпочтительно проводить внеплацентарно, в свободном от петель пуповины наибольшем кармане. Если иглу необходимо ввести трансплацентарно, выбирают наиболее тонкий участок плаценты, не имеющий расширенных межворсинковых пространств. Амниоцентез проводят с помощью игл, имеющих диаметр 18-22G. Технически амниоцентез производят методом «свободной руки» или с использованием пункционного адаптера, помещённого на конвексный абдоминальный датчик. Его использование позволяет контролировать траекторию движения и глубину погружения пункционной иглы с помощью трассы на экране монитора. Убедившись в том, что игла после пункции расположена в полости плодного пузыря, из неё извлекают мандрен, присоединяют шприц и аспирируют необходимое количество околоплодных вод. После этого в просвет иглы вновь помещают мандрен и удаляют её из полости матки. После окончания процедуры осуществляют оценку состояния плода (наличие и частоту его сердцебиения). При выполнении амниоцентеза в третьем триместре беременности рекомендуют выполнение мониторного наблюдения за состоянием плода. По показаниям проводят сохраняющую терапию, интраоперационную антибиотикопрофилактику и/или терапию.

Осложнения амниоцентеза

• Преждевременное излитие околоплодных вод.

• Возможно кратковременное подтекание небольшого количества ОВ в течение первых суток после операции (в 1-2% случаев).

• Отслойка плодных оболочек.

• Инфицирование (наиболее неблагоприятен в отношении инфицирования второй триместр беременности вследствие низкого уровня антибактериальной активности околоплодных вод).

• Развитие аллоиммунной цитопении у плода.

• Кордоцентез - метод получения кордовой (пуповинной крови) плода для дальнейшего исследования.

• Обычно производится параллельно амниоцентезу (взятию околоплодных вод). Производится не ранее 18 недель гестации.

• Через переднюю брюшную стенку беременной после инфильтрационной анестезии под контролем ультразвукового аппарата производят прокол тонкой пункционной иглой, попадают в сосуд пуповины, получают до 5 мл. крови.

• Метод применим для диагностики хромосомных и наследственных заболеваний, резус - конфликта, гемолитической болезни плода и т.д.

4. Материнский тип наследования.

Материнский эффект цитоплазмы заключается во влиянии генотипа матери на характер потомства первого поколения, передаваемый через свойства цитоплазмы яйцеклеток. В результате потомство развивается в значительной степени в соответствии с генотипом матери и независимо от особенностей собственного генотипа.

В чем причины материнского типа наследования, когда он не связан с проявлением генов митохондриальной ДНК?

Как известно, при формировании ооцитов в них накапливаются рибосомы, а также молекулы мРНК и различные структурные белки и ферменты. Все эти запасенные молекулы необходимы в тот период времени, пока не функционирует собственная белок-синтезирующая система в делящейся зиготе. У позвоночных до стадии гаструлы синтез белка происходит с материнских мРНК, а затем начинается экспрессия собственных генов зародыша. У дрозофилы из питающих клеток в ооцит попадают различные первичные продукты материнских генов. К генам с материнским эффектом относятся гены, контролирующие переднезаднюю полярность зародыша. К ним относятся bicoid (bed), nanos (nos), pumiiio (рыт), trunk (trk) и др. Первичные продукты этих генов (РНК или белка) распределяются с различной концентрацией подлине яйца. Мутации генов с материнским эффектом, нарушая сегментарную структуру личинок дрозофилы, действуют как летали.

Материнский эффект характерен для наследования формы раковины (направления ее завитка) у прудовика Limnaea peregra. Ген D у прудовика Limnaea peregra определяет правозавитковость раковины, dd - левозавитковостъ. При разных направлениях скрещиваний DD x dd и dd x DD фенотип первога поколения определяется генотипом материнской формы. При скрещивании материнских правозавитковых прудовиков с отцовскими левозавитковыми в первом поколении все моллюски имеют раковину, закрученную в правую сторону. При реципрокном направлении, напротив, у первого поколения проявляется материнский фенотип (левозавитковость), Таким образом, фенотип первого поколения зависит от того, под влиянием каких генов формируется цитоплазма яйцеклеток. Прудовик — гермафродит и скрещивание у него возможно как между разными особями, так и самооплодотворение.

В случае самооплодотворения улиток первого поколения с генотипом Dd х Dd во втором поколении все улитки имеют раковину, закрученную в правую cropoiry вне зависимости от генотипа (DD, Dd, dd). Левозавитковые формы появляются уже в третьем поколении от скрещивания dd x dd. Как выяснилось, направление завитка раковины определяется положением веретена деления от средней линии при первых двух делениях зиготы.

Подводя итоги, остановимся еще на одном важном вопросе; в каких случаях можно предполагать нехромосомный тип наследования? На это указывают:  • отсутствие менделевского наследования (исходное положение);  • передача признака по материнскому типу вне зависимости от направления скрещивания;  • сохранение наследования признака по материнскому типу при замене хромосом женского организма на хромосомы мужского организма (цитоплазматическая мужская стерильность).

В клинической генетике диагностическими критериями митохоцдриального заболевания служат;  • аномальные структуры митохондрий, выявленные при морфологическом исследовании мышечных биоптатов («рваные красные мышечные волокна»);  • мутации (точковые мутации, делеции, дупликации) в мтДНК, обнаруженные в молекул ярно-генетических исследованиях;  • повышение концентрации метаболитов (в крови и мышечных биоптатах), являющихся биохимическими маркерами нарушения окислительного фосфорилирования;  • изменение активности ферментов дыхательной цепи митохондрий в мышечном биоптате больных (дефицит дегидрогеназы, цитохром-с-оксидазы и др.). Таким образом, генетическая система эукариот состоит из двух подсистем: нуклеотипа и цитотипа, Эти две системы, занимающие разные компартменты клетки, имеют различную весовую категорию. Бесспорно, главную роль играет ядро и по количеству генов и по их значимости для функционирования клетки и организма. Однако без митохондриальной и хлоропластной ДНК, которые принимают участие наряду с ядерными генами в кодировании белков и ферментов, обеспечивающих получение энергетической молекулы АТР, биохимическая фабрика клетки функционировать не может. Белок-синтезирующая система митохондрий и хлоропластов обладает определенной степенью автономности, поскольку в мтДНК и хлДНК имеются гены рРНК, тРНКи гены немногих рибосомных белков.

В цитоплазматических органеллах имеются собственные рибосомы, однако большинство рибосомных белков и все факторы трансляции кодируются ядерными генами. Белки, участвующие в биосинтезе АТР находятся под двойным контролем - хромосомных и цитоплазматических генов. Мутации как ядерных, так и хлоропластных и митохондриальных генов, нарушающих функционирование цитоплазматическихорганелл, приводят к снижению энергетического обеспечения клеток и, как следствие, к проявлению мутантного фенотипа. У человека мутации мтДНК вызывают болезни нервной системы, зрительных нервов, сердечной и скелетных мышц.

10.Клонирование генов + 25. Генная инженерия

Генетическая инженерия – совокупность методов, позволяющих создавать in vitro рекомбинантные молекулы ДНК, с последующим введением этих новых генетических структур в живую клетку. Так как с химической точки зрения ДНК всех организмов однотипна, то in vitro возможно воссоединение фрагментов ДНК из любых организмов. В этом смысле рекомбинация in vitro отличается от обычной генетической рекомбинации, которая требует гомологии ДНК и, как правило, осуществляется в пределах одного или близкородственных видов. Другими словами, обычные методы обмена генетической информацией (конъюгация, трансдукция, трансформация) позволяют провести обмен генами внутри одного вида, тогда как генетическая инженерия, в принципе, открывает возможность, для перемещения генов в пределах всех живых организмов. Для того чтобы осуществить генно-инженерный эксперимент, т. е. создать рекомбинантную ДНК и ввести ее в клетку другого организма, необходимо соблюсти следующие условия: • иметь инструменты для разрезания молекул ДНК на фрагменты; • иметь инструменты для соединения фрагментов ДНК, выделенных из различных источников; • подобрать переносчик, или вектор генов, предназначенных к введению в клетку другого организма. Этот вектор должен самостоятельно реплицироваться в клетке и обеспечивать репликацию введенного фрагмента ДНК; • разработать способ введения гибридных или рекомбинантных молекул ДНК в живую клетку; • определить метод отбора (селекции) клона реципиентной клетки, воспринявшей гибридную молекулу ДНК. Самыми удобными векторами являются плазмиды, так как они, во-первых, способны реплицироваться независимо от хромосомной ДНК бактерий. Во-вторых, плазмиды содержат гены, благодаря которым по фенотипу можно отделить бактерии, содержащие плазмиды, от бактерий, лишенных плазмид. Например, R-плазмиды содержат структурные гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам. При высеве бактерий, содержащих такие R-плазмиды, на среду с антибиотиком они будут расти и формировать колонии, бактерии, лишенные их, на среде с антибиотиком не вырастут. Резать молекулы ДНК на фрагменты можно с помощью ферментов рестриктаз. Необходимо подобрать специфическую рестриктазу, которая имела бы сайты узнавания на двух молекулах ДНК (плазмиде и ДНК, из которой вырезаются переносимые гены) и резала бы их с образованием липких концов. Рестриктаза не должна резать ДНК плазмиды в области, ответственной за репликацию, и в области структурных генов, детерминирующих фенотип плазмиды. Соединять или сшивать фрагменты ДНК можно с помощью ферментов полинуклеотидлигаз. Вводить рекомбинантные молекулы ДНК можно с помощью трансформации. Рекомбинантной ДНК обрабатывают реципиентные клетки (клетки, в которые клонируется нужный ген) и через определенный промежуток времени выдерживания при оптимальной температуре смесь высевают на селективную среду, позволяющую отобрать по фенотипу клоны, воспринявшие плазмиду. Метод клонирования нашел широкое применение. С его помощью можно получать микробиологическим путем продукты, использующиеся человеком. В настоящее время разработаны методы микробиологического получения гормона инсулина, в котором нуждаются больные диабетом. Раньше его получали путем экстрагирования из поджелудочных желез коров, свиней, что очень сложно и дорого. Разработаны методы получения интерферонов – белков, обладающих антивирусным действием; соматостатина – гормона роста и др. Гены, детерминирующие синтез этих веществ, клонированы в основном в клетках E. coli.

12. Методы изучения структуры и функции гена.

Современные методы генетики

Совокуп­ность методов исследования наследственных свойств организма (его генотипа) называется генетический анализ.

В зависимости от за­дачи и особенностей изучаемого объекта генетический анализ проводят на популяционном, организменном, клеточном и молекулярном уровнях.

 

Основу генетического анализа составляет гибридологический анализ, основанный на анализе наследования признаков при скрещиваниях.

Гибридологический анализ, основы которого разработал основатель современной генетики Г. Мендель, основан на следующих принципах.

1. Использование в качестве исходных особей (родителей), форм, не дающих расщепления при скрещивании, т.е. константных форм.

2. Анализ наследования отдельных пар альтернативных признаков, то есть признаков, представленных двумя взаимоисключающими вариантами.

3. Количественный учет форм, выщепляющихся в ходе последовательных скрещиваний и использование математических методов при обработке результатов.

4. Индивидуальный анализ потомства от каждой родительской особи.

5. На основании результатов скрещивания составляется и анализируется схема скрещиваний.

Гибридологическому анализу обычно предшествует селекционный метод. С его помощью осуществляют подбор или создание исходного  материала,  подвергающегося дальнейшему анализу (например, Г. Мендель, который по существу является основопо­ложником генетического анализа, начинал свою работу с получения константных – гомозиготных – форм гороха путём самоопыле­ния);

Однако в некоторых случаях метод прямого гибридологического анализа оказывается неприменим. Например, при изучении наследования признаков у человека необходимо учитывать ряд обстоятельств: невозможность планирования скрещиваний, низкая плодовитость, длительный период полового созревания. Поэтому кроме гибридологического анализа, в генетике используется множество других методов.

 

Цитогенетические методы.

Цитогенетика – это раздел генетики, изучающий видимые носители генетической информации: митотические, мейотические и политенные хромосомы, интерфазные ядра, в меньшей степени – митохондрии и пластиды. Следовательно, цитогенетические методы – это, в первую очередь, методы изучения хромосом: подсчет их числа, описание структуры, поведения при делении клетки, а также связь между изменением структуры хромосом с изменчивостью признаков.

Цитогенетические методы заключаются в цитологическом анализе ге­нетических структур и явлений на основе гибридологического анализа с целью сопостав­ления генетических явлений со структурой и поведением хромосом и их участков (анализ хромосомных и геномных мута­ций, построение цитологических карт хромо­сом, цитохимическое изучение активности ге­нов и т. п.). Частные случаи цитогенетического метода – кариологический, кариотипический, геномный анализ.

Для изучения структуры хромосом и других носителей наследственной информации используются методы световой микроскопии и методы электронной микроскопии.

 

Популяционные методы. На основе популяционного метода изучают генетическую структуру популяций различных организмов: количественно оцени­вают распределение особей разных гено­типов в популяции, анализируют дина­мику генетической структуры популяций под действием различных факторов (при этом ис­пользуют создание модельных популя­ций). Подробнее популяционные методы описаны в соответствующей лекции.

 

Молекулярно-генетические – биохимические и физико-химические – методы включают разнообразные, направленные на изучение структуры и функции генетического материала и направлен на выяснение этапов пути «ген – при­знак» и механизмов взаимодействия различных молекул на этом пути.

 

Мутацион­ные методы позволяет (на основе всестороннего анализа мутаций) устано­вить особенности, закономерности и меха­низмы мутагенеза, помогает в изучении структуры и функции генов. Особое зна­чение мутационный метод приобретает при ра­боте с организмами, размножающимися бесполым путём, и в генетике человека, где возможности гибридологического анализа крайне затруднены. Подробнее мутационные методы описаны в соответствующей лекции.

 

Генеалогический метод (метод анализа родословных). Позволяет проследить наследование признаков в семьях. Используется для определения наследственного или ненаследственного характера признака, доминантности или рецессивности, кар­тирования хромосом, т. е. для установления принадлежности гена, кодирующего данный признак, к определенной группе сцепления, сцепленности с Х- или Y-хромосомами, для изучения мутационного процесса, особенно в случаях, когда необходимо отличить вновь возникшие мутации от тех, которые носят семейный характер, т. е. возникли в предыдущих поколениях. Как правило, генеалогический метод составляет основу для заключений при медико-генетическом консультировании (если речь не идет о хро­мосомных болезнях). Подробнее генеалогический метод описан в соответствующей лекции.  

 

Близнецовый метод, заключающийся в анализе и сравнении изменчивости признаков в пре­делах различных групп близнецов, позволяет оценить относит, роль генотипа и внешних условий в наблюдаемой изменчивости. Особенно важен этот метод при работе с малоплодовитыми организмами, имею­щими поздние сроки наступления половой зрелости (например, крупный рогатый скот), а так­же в генетике человека. Подробнее близнецовый метод описан в соответствующей лекции.

 

Методы биотехнологии включают методы клеточной инженерии, а также методы генной инженерии, описанные в соответствующей лекции.

 

В генетическом анализе исполь­зуют и многие другие методы:

онтогенетический,

иммуногенетический,

сравнительно-морфологические и сравнительно-биохимические методы,

разнообразные математические методы и т. д.

3. Молекулярно-генетические методы

Выделение и разделение компонентов клетки. Цитохимические методы. Биофизические методы.

 

К биохимическим методам изучения клеток относятся: цитохимические методы, авторадиография, хроматография, гель-электрофорез и различные комбинации этих методов.

 

Выделение и разделение компонентов клетки. Для изучения химического состава компонентов клетки необходимо произвести разделение этих компонентов. Первоначально производится грубое измельчение образцов, например, ножницами. Затем производится разрушение клеток, например, в шаровых мельницах или растиранием в ступке с кварцевым песком. Для более полного разрушения клеток используют специальные приборы – гомогенизаторы. Для сохранения первоначального строения внутриклеточных структур все операции производят на холоду (от 0 до +4 ^ОС) в растворе сахарозы (обычно 0,25 М).

Для выделения изолированных клеточных структур используют центрифугирование при ускорении от 600g до 10000g и более. При этом удается выделить следующие фракции (начиная от дна центрифужной пробирки): ядра, митохондрии, крупные фрагменты мембран, лизосомы, водорастворимые компоненты. Каждый из компонентов содержит собственные специфические вещества (биохимические маркёры), например, фрагменты плазмалеммы содержат натрий-калиевый переносчик (Na,К–АТФазу), лизосомы содержат гидролитические ферменты, пероксисомы содержат каталазу и т.д.

 

Цитохимические методы. Для изучения химического состава центрифужных фракций применяются цитохимические методы микрохимического и ультрахимического анализа. Например, ксантопротеиновая реакция указывает на наличие в составе белков тирозина, фенилаланина, триптофана. Специфичность ферментов выявляется их взаимодействием с субстратом. Например, разложение пероксида водорода указывает на наличие каталазы.

 

К цитохимическим методам близок метод меченых атомов (метод авторадиографии). Этот метод основан на введении в клетки радиоактивных изотопов: трития ³Н, углерода¹⁴С, серы ³⁵S, фосфора ³²Р, йода ¹³¹I и других. Через определенные промежутки времени из обработанных образцов готовятся препараты. На поверхность этих препаратов наносится тонкий слой фотоэмульсии, содержащей галогениды серебра. При наличии в определенных участках клетки радиоактивного изотопа на фотоэмульсии появляется засветка. По локализации засветок выявляют те участки клеток, в которых наиболее активно протекают определенные биохимические реакции. Например, если в состав тимидина включить тритий, то можно проследить репликацию ДНК.

 

Хроматография – это метод, применяемый для разделения различных смесей на составляющие их компоненты. Этот метод основан на том, что в неподвижной среде, через которую протекает растворитель, каждый из компонентов, увлекаемых растворителем, движется со своей собственной скоростью независимо от других. Например, этим способом можно легко разделить пигменты листьев (хлорофиллы, каротиноиды, фикобиллины, антоцианы). С помощью хроматографии российский физиолог М.С. Цвет доказал, что хлорофилл у высших растений представлен двумя формами: a и b. Различная подвижность разных веществ зависит от их массы и растворимости в данном растворителе. В зависимости от природы используемой неподвижной среды различают три главных типа хроматографии: бумажную, колоночную и тонкослойную.

 

Гель-электрофорез – это метод, основанный на различной подвижности заряженных частиц, обладающих индивидуальностью: белков, фрагментов ДНК и РНК. Образцы тканей измельчают и выделяют отдельные фракции органических веществ. Каплю раствора, содержащего то, или иное вещество, наносят на поверхность геля (крахмального, агарозного, полиакриламидного или другого). Затем образец помещают в электростатическое поле. Заряженные частицы начинают двигаться в этом поле, причем, скорость движения зависит от массы части и их заряда (заряд частиц зависит от кислотности среды, поэтому гель-электрофорез проводят при определенном значении рН). Через несколько часов процесс заканчивают, и гель-электрофореграмму проявляют соответствующим реактивом. В результате наблюдают чередование полос, каждая из которых представлена определенной фракцией высокомолекулярного вещества.

Существует множество модификаций гель-электрофореза. Например, существует гель-электрофорез при переменной кислотности (в градиенте рН), при переменном напряжении (пульс-форез).

При двумерном электрофорезе процесс проводят на плоскости. Тогда первоначально полученные фракции расщепляют на фрагменты (например, белки расщепляют на олигопептиды протеазами, а ДНК расщепляют на олигонуклеотиды нуклеазами). Затем электромагнитное поле поворачивают на 90^О, и процесс повторяют.

Для идентификации тех, или иных участков макромолекул используют их гибридизацию с радиоактивными зондами (например, блот-гибридизацию). С помощью гибридизации можно с высокой точностью установить аминокислотную последовательность в молекулах белков или нуклеотидную последовательность ДНК. Такие гель-электрофореграммы уникальны для каждого генотипа и используются для генной дактилоскопии.

 

см. также: Графические материалы

 

Биофизические методы

К основным биофизическим методам изучения клеток относятся: электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), сканирующая калориметрия, различные виды спектроскопии (например, спектр-фотометрия, масс-спектроскопия, флуоресцентная спектроскопия). Эти методы требуют применения специального оборудования.

17. ДНК-фингерпринтинг

Использование днк в технологии Генетическая инженерия

Современные биология и биохимия интенсивно используют методы, основанные на рекомбинантной ДНК. Рекомбинантная ДНК — искусственно созданная человеком последовательность ДНК, части которой могут быть синтезированы химическим путём, с помощью ПЦР(полимеразная цепная реакция) или клонированы из ДНК различных организмов. Рекомбинантные ДНК могут быть трансформированы в клетки живых организмов в составе плазмид или вирусных векторов. Генетически модифицированные животные и растения обычно содержат рекомбинантные гены, встроенные в их хромосомы. В то время как генетически модифицированные бактерии и дрожжи используются для производства рекомбинантных белков, животные используются в медицинских исследованиях, а растения с улучшенными пищевыми качествами — в сельском хозяйстве .

Судебно-медицинская экспертиза

Судмедэксперты используют ДНК в крови, сперме, коже, слюне или волосах, обнаруженных на месте преступления для обнаружения преступника. Процесс идентификации называется генетический фингерпринтинг более точно, определение профиля ДНК. В фингерпринтинге сравниваются вариабельные ДНК генома, например, короткие тандемные повторы и минисателлитные последовательности разных людей. Это очень надёжный метод определения преступников , хотя определение может быть затруднено при загрязнении сцены преступления ДНК других людей.

Фингерпринтинг был изобретён в 1984 британским генетиком Алеком Джеффрейс (Alec Jeffreys)  и впервые был использован как доказательство в суде над Колином Питчфорком (Colin Pitchfork) в деле, где он был обвинён в убийстве и изнасиловании^.

В настоящее время во многих западных странах, например, Великобритании у преступников, обвинённых в преступлениях некоторых типов, забирается образец ДНК для базы данных. Это помогло обнаружить виновных в ранее нераскрытых преступлениях, поскольку ДНК сохраняется на вещественных доказательствах. Ещё этот метод используется для определения личности в случае массовой гибели людей.

С 1 января 2009 года в России принимается федеральный закон "О государственной геномной регистрации в Российской Федерации". Геномная регистрация объявляется обязательной процедурой для определённых групп лиц (заключённые и бывшие заключённые, неустановленные лица), а также добровольной для остальных граждан. Этот закон поможет сократить количество преступлений, а также будет являться доказательством в судебных разбирательствах при решении вопросов наследования, назначении алиментов. Добровольный анализ ДНК используется при установлении отцовства/материнства, с целью получения прав родственника, или прав наследника при наследовании имущества, а также при определении генетической предрасположенности к заболеваниям или пагубной зависимости.

18. Механизмы онтогенетической изменчивости.

Разновидностью фенотипической изменчивости является онтогенетическая изменчивость, которая связана с определенной схемой развития организма в процессе онтогенеза, при этом генотип не претерпевает изменений, а фенотип меняется в соответствии с каждым этапом развития, благодаря морфогенезу и дифференцировке клеток. Морфогенез — это возникновение новых структур на каждом этапе развития, определяемое генетическим аппаратом клеток, может осуществляться благодаря контактным и дистантным межклеточным взаимодействиям, которые контролируют этот процесс. В случае нарушений морфогенеза возникают тератомы (уродства), в том числе и новообразования. Поскольку эти механизмы связаны с «включением» и «выключением» генов, изменчивость этого рода называется — «парагеномная», «эпигенетическая», «эпигенотипическая» или «эпигеномная». Порядок изменений нарушаться не может (выпасть или перескочить), т.к. схема развития определена геномом. Например, один и тот же человек в разные периоды своей жизни выглядит по-разному. Фенотипическое проявление любого признака обусловлено, в конечном счете, результатом взаимодействия генов и средовых факторов. Су шествуют две формы изменчивости: дискретная и непрерывная. При дискретной изменчивости четко выражены фенотипы, а промежуточные формы отсутствуют (например, группы крови у человека, резус-фактор). Признаки, для которых характерна дискретная изменчивость, обычно контролируются одним или двумя генами, и внешние условия мало влияют на их фенотипическую экспрессию. Ее иногда называют качественной изменчивостью, поскольку она ограничена четко выраженными признаками, в отличие от количественной непрерывной изменчивости. У человека примерами непрерывной изменчивости могут быть линейные размеры тела, вес, колебания кровяного давления, рН крови и т.д. Признаки, для которых характерна непрерывная изменчивость, обусловлены, как правило, совместным взаимодействием многих генов и факторов среды. Генотип детерминирует любой фенотипический признак, но степень выраженности (экспрессия) этого гена зависит от средовых факторов. Непрерывную фенотипическую изменчивость можно определить как скумулятивный эффект» варьирующих факторов среды, воздействующих на вариабельный генотип. Что касается таких человеческих качеств, как интеллект, поведение, темперамент, они зависят как от наследственных, так и средовых факторов. Именно эти различия создают фенотипическую индивидуальность у людей. Согласно современным концепциям, именно взаимодействия генетической и средовой изменчивости являются ведущими в формировании фенотипического разнообразия психологических и психофизиологических особенностей человека. Эта область исследований является пограничной между генетикой и психологией и в настоящее время обозначается как психогенетика. Исследование закономерностей генотип-средового взаимодействия и психологических закономерностей является предметом изучения психогенетики.

 

23. Инбридинг и гетерозис

Различают два способа полового размножения: аутбридинг — неродственное размножение и инбридинг (инцухт) — близкородственное размножение.

Неродственное (аутбридинг) размножение ведет к повышению изменчивости, увеличивая гетерозиготность. Родственное (инбридинг) размножение, напротив, увеличивает гомозиготность и константность потомства в популяции, а также вызывает депрессию, связанную с переходом вредных или летальных генов в гомозиготное состояние.

Принудительный инбридинг (инцухт) перекрестноопыляющихся организмов сопровождается инбредным вырождением (инцухт-депреосией): снижением показателей количественных признаков у линий и выщеплением в них погибающих, стерильных и уродливых экземпляров. И примерно в пятом инцухт-поколении достигается инбредный минимум, который совпадает с наступлением относительно полной гомозиготности.

Явлением, противоположным инбредному вырождению, является гетерозис, т. е. преобладание первого поколения гибридов по степени выраженности признаков и свойств над каждой родительской формой. Во втором поколении гетерозис заметен сравнительно слабо, а в третьем практически полностью затухает. Гетерозис является следствием возникновения удачной комбинации генов многих локусов и проявляется при скрещиваниях разных удачно подобранных гетерогенных сортов одного вида, а также при скрещиваниях отдаленных в генетическом отношении форм. У ряда сельскохозяйственных культур наиболее часто и сильно выражен гетерозис и в достаточной степени поддается управлению при скрещивании самоопыленных чистых, или инцухт-линий. Для получения гибридных семян скрещивают разные инцухт-линии между собой, либо скрещивают инцухт-линию с каким-то сортом.

Различают истинный гетерозис как явление превосходства первого поколения гибрида над лучшей родительской формой; гипотетический гетерозис, когда эффект определяют по средней продуктивности обоих родителей; различают также по типу проявления — репродуктивный, соматический и приспособительный (адаптивный) гетерозис.

26. Проблемы экологической генетики

НЕСКОЛЬКО ОПРЕДЕЛЕНИЙ

Что же такое экологическая генетика? Определяя содержание этой области знания, можно оставаться в рамках представлений того периода, когда Е.Б. Форд в 60-х годах впервые сформулировал понятие об экологической генетике как о генетике популяций в природных условиях. Можно понимать экологическую генетику более широко, как область, перекрывающую почти всю современную генетику Нам представляется, что, определяя предмет экологической генетики, необходимо исходить из исторической логики развития биологии и методологических возможностей обеих наук - экологии и генетики, давших название новой области как пограничной науке.

Общепринято определение экологии как науки об отношениях организмов с окружающей средой, а также с другими организмами, составляющими часть этой среды. Определение генетики как физиологии наследственности и изменчивости, данное еще в 1906 году У. Бэтсоном ; сохраняет свое значение до сих пор. Отталкиваясь от этих общих представлений, рискнем дать определение экологической генетики.

Экологическая генетика - это область знания, исследующая взаимовлияние генетических процессов и экологических отношений. При этом как раздел генетики эта наука опирается на мощную методологию генетического анализа и использует весь методический арсенал экологии

Структуру экологической генетики несколько упрощенно можно представить в виде табл. 1. Обсуждение содержания табл. 1 поможет нам обсудить структуру и задачи экологической генетики более конкретно.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ

Генетические подходы в экологической генетике базируются на двуединстве методологии генетического анализа, оперирующего понятиями наследственности и изменчивости. Прежде всего наследственность - это свойство сходства родственных организмов, их способность передавать определенные признаки из поколения в поколение. При этом в качестве признаков могут фигурировать наличие или отсутствие органов, их число, размер, цвет; способность проводить те или иные биохимические реакции; свойства нервной системы, тип поведения и т.д. Генетический анализ вскрывает гены, контролирующие все это разнообразие признаков, изучает их наследование и локализацию в геноме. Следует особо остановиться на важном для генетики понятии элементарных признаков, то есть таких признаков, различия по которым наследуются в соответствии с менделевской моногибридной схемой как аллели одного гена. Очевидно, что в природе дело обстоит, как правило, значительно сложнее и мы сталкиваемся обычно с полигибридными схемами наследования. Тем не менее установление элементарных признаков, разложение более сложных признаков на составляющие их элементарные и являются важнейшей задачей генетического анализа. Более того, именно этот подход и обусловил быстрый прогресс генетики в XX столетии.

Кроме того, генетический анализ вскрывает причины изменчивости, то есть отвечает не только на вопрос: "Почему организмы имеют сходство между собой?" - но и на вопрос: "Почему организмы отличаются друг от друга?" Особое внимание при этом уделяется причинам, механизмам и последствиям мутационной изменчивости, то есть наследуемых изменений генетического материала. Как известно, мутации могут быть спонтанными, возникающими, казалось бы, без какой-либо внешней причины, а также индуцированными, возникающими под действием различных внешних агентов: физических, химических и т.д. Не менее важен также вопрос о механизмах модификаций (не наследуемых изменений), которые хотя и не передаются из поколения в поколение, тем не менее часто имеют адаптивный характер и складываются в онтогенезе на основе наследуемых признаков.

Мутационный процесс обычно связывают с так называемыми генетическими процессами. К ним обычно относят репликацию - воспроизведение генетического материала; рекомбинацию - различные способы пересортировки генов и их частей, происходящие при смене поколений, и репарацию - процессы, поддерживающие нативную структуру генетического материала, постоянно повреждаемого под влиянием как внутренних факторов (физиологических, метаболических), так и внешних факторов (температуры, излучений, химических воздействий). Спонтанные или индуцированные нарушения этих процессов, лежащих в основе наследственной передачи генетического материала, являются причиной наследственной изменчивости - мутационного процесса.

К числу генетических процессов относят также транскрипцию - синтез РНК на матрице ДНК и трансляцию - синтез белков на матрицах информационных РНК. Это уже процессы, лежащие в основе реализации генетической информации, в основе действия генов. Их нарушения в значительной степени ответственны за модификационную изменчивость.

Механизмы наследования признаков, а также механизмы наследственной изменчивости изучены довольно подробно, чего нельзя сказать о механизмах модификаций. Это приходится учитывать в работе, тем более что адаптивные модификации играют важную роль в экологических отношениях. Следует оговориться, что в генетике часто употребляют также понятие генетические процессы в популяциях, то есть процессы, влияющие на частоты генов (точнее, их аллелей) в популяциях организмов и обусловливающие микроэволюционные преобразования.

ТИПЫ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ

Экологические отношения делят на синэкологические (отношения между организмами) и аутэкологические (отношения организмов с окружающей средой). При всей полезности такого деления следует признать его относительность, поскольку многие факторы окружающей среды имеют биотическое происхождение. Тем не менее будем пользоваться таким делением, поскольку оно позволяет формализовать ситуацию, что необходимо на первых порах знакомства с новой областью знания.

Синэкология исследует как отношения между организмами одного вида, так и отношения между организмами разных видов, объединяемых в экосистемы. Чаще всего эти отношения основываются на взаимозависимости разных видов, составляющих различные этапы пищевых цепей. Знание пищевых цепей в природе необходимо для прогнозирования последствий любых воздействий на экосистемы.

Хорошо известен пример того, к чему привело игнорирование структуры пищевых цепей при попытке уничтожить комаров на озере Клир-Лэйк в США. После использования для этой цели инсектицида ДДТ (4,4-дихлор-дифенилтрихлорэтана) его концентрация в воде составила 0,02 части на 106, в планктоне - 10 на 106, в рыбах, питающихся планктоном, - 903 на 106, в хищных рыбах - 2690 на 106, а в рыбоядных птицах - 2134 на 106. Таким образом, концентрация ДДТ увеличилась в 100 тыс. раз по мере продвижения вверх по пищевой цепи, что привело к сокращению численности птиц на озере Клир-Лэйк. Главная опасность применения ДДТ заключается в сочетании его токсичности и стабильности, характерных для хлорорганических соединений, к которым он относится.

Аутэкология рассматривает отношения живых существ с факторами окружающей среды преимущественно абиотического происхождения. При этом подобные абиотические факторы могут быть естественными, с которыми живые организмы сталкивались неоднократно в ходе эволюции. Это различные температурные воздействия, земное тяготение, различные виды излучений - от видимой части спектра до рентгеновских лучей, многие химические агенты и т.д. В ходе эволюции живые существа вырабатывали адаптивные реакции на такого рода воздействия, в результате чего возникала устойчивость организмов к действию повреждающих воздействий в определенных пределах. Многим химическим агентам живые существа противостоят путем включения их в собственный метаболизм или в пищевые цепи экосистем.

Сложнее обстоит дело с новыми, как правило антропогенными, факторами внешней среды, которые никогда не встречались в природе в ходе биологической эволюции. Так, например, многие инсектициды - хлорированные углеводороды никогда не существовали в природе. Они не трансформируются в пищевых цепях и потому неразложимы биологическим путем, что не учитывалось при их применении. К ним относятся полихлорбифенилы, в частности пестициды: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) или 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) - эффективные дефолианты. Притчей во языцех становятся в последнее время диоксины, также относящиеся к полихлорированным бифенилам и представляющие собой самые активные яды, известные в настоящее время. Один из них входил в состав печально известного agent orange, применявшегося армией США во Вьетнаме в качестве боевого дефолианта. Диоксины образуются также при сжигании мусора в больших количествах на заводах по уничтожению городских отходов.

В списке наиболее значимых антропогенных факторов загрязнения среды (из 19 наименований) первые пять мест занимают: 1) пестициды; 2) тяжелые металлы; 3) диоксид углерода; 4) диоксид серы и продукты ее окисления, взвеси; 5) разливы нефти, сточные воды промышленных предприятий. При этом радиоактивные отходы, обладающие несомненной генетической активностью, стоят только на 12-м месте как загрязнители. Правда, мы очень скоро убедимся, что непосредственное влияние загрязнений на комфорт и здоровье человека может быть несопоставимо с отдаленными последствиями тех или иных изменений окружающей среды.

ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ

Применение методов генетического анализа, как уже было отмечено, связано с выявлением элементарных признаков. Это же справедливо и для генетического анализа экологических отношений, которые обычно сложны. Поэтому необходима разработка специальных эколого-генетических моделей. Большую помощь в этих случаях оказывает знание пищевых цепей, особенно если в них организмы одной экосистемы выступают как продуценты и потребители каких-либо метаболитов. Примером таких взаимоотношений может служить взаимодействие почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, размножающейся вблизи корней крестоцветных растений. При этом агробактерии вступают в столь тесное взаимодействие с корнями растения, что передают им часть своей плазмидной ДНК (часть так называемой Ti-плазмиды), которая встраивается в хромосомы высшего растения. Это приводит к образованию растительных опухолей, которые начинают интенсивно синтезировать некоторые аналоги аминокислот - опины, производные лизина, гистидина, орнитина или аргинина. Эти соединения, в свою очередь, служат дополнительным источником азота для агробактерий и тем самым стимулируют их размножение. Такое взаимоотношение бактерий и растения получило название генетической колонизации (рис. 1). Стоит отметить, что способность Ti-плазмиды трансформировать клетки растений легла в основу методов генной инженерии растений, однако это уже другая тема. Здесь важно подчеркнуть, что биосинтез опинов происходит частью под контролем генов растения, а завершается под контролем генов агробактерии, передаваемых в клетки растения. Генетический контроль этих процессов, а следовательно, и взаимосвязи агробактерия - растение довольно подробно исследованы. Таким образом, это пример эколого-генетической модели. Интенсивно разрабатываются и другие эколого-генетические модели, включающие иные почвенные бактерии, в частности азотфиксирующие. Практические выгоды от разработки этого направления очевидны - возможность управления процессом азотфиксации и симбиотическими отношениями бактерий и высших растений.

Еще один пример элементарной эколого-генетической модели - взаимоотношение членистоногих - клещей, насекомых и высших растений. В этой системе насекомые-вредители сельского хозяйства и сельскохозяйственные растения связаны как потребители и продуценты стеринов. Стерины, которые членистоногие не могут синтезировать самостоятельно, тем не менее являются для них незаменимыми метаболитами. Насекомые получают их с пищей из растений.

Выявление генов, отвечающих за элементарные экологические отношения, позволяет использовать генетический контроль для регулирования этих отношений и тем самым выбирать оптимальную стратегию сдерживания вредителей сельского хозяйства вместо того, чтобы вести с ними тотальную войну на уничтожение. Как мы показали, такая война оборачивается часто против самого человека.

ГЕНЕТИКА УСТОЙЧИВОСТИ

К ФАКТОРАМ СРЕДЫ

Изучение генетического контроля устойчивости модельных объектов, в особенности сельскохозяйственных растений, животных и человека к неблагоприятным внешним факторам имеет большое значение для селекции, медицины и поддержания оптимальной среды обитания человека.

Прежде всего остановимся на так называемых молекулярных болезнях человека. Известны, в частности, наследственные аномалии репликации и репарации ДНК. У человека, например, существуют различные формы болезни пигментной ксеродермы. Это рецессивный аутосомный дефект репарации, в частности дефект ДНК-полимеразы, принимающей участие в репарации. Больные пигментной ксеродермой проявляют повышенную чувствительность к солнечному свету, который вызывает у них рак кожи. Дефекты систем репарации выявлены и при других наследственных заболеваниях (анемия Фанкони, синдром Луи Бар). При радиотерапии таких больных наблюдаются осложнения, часто со смертельным исходом.

В человеческих популяциях обнаруживается генетическая гетерогенность по многим признакам, в том числе по чувствительности к факторам окружающей среды, устойчивости к стрессирующим агентам и условиям вредного производства. Так, у людей с низкой активностью глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы происходит гемолиз при действии сульфаниламидов, а некоторые больные с генетическими дефектами реагируют повышением внутриглазного давления на прием глюкокортикоидов. Некоторые мутантные формы гемоглобина чувствительны к окислителям, что выражается в гемолизе при их применении. Люди с повышенной активностью арилгидрокарбонгидроксилазы чаще заболевают раком легких при контакте с полициклическими углеводородами, которые под действием этого фермента превращаются в эпоксиды, обладающие высоким уровнем канцерогенности.

Такие факты необходимо учитывать при планировании медицинских мероприятий, при приеме людей на работу и их профориентации. Очевидно, что эти факты могут быть причиной и некоторых социально-экономических проблем. Возникают, в частности, такие вопросы. Можно ли допускать дискриминацию при приеме на вредные производства по генетическим противопоказаниям? Каковы должны быть условия страхования людей, имеющих дополнительные факторы риска в виде генетической предрасположенности к тем или иным заболеваниям? Простых ответов на эти и подобные им вопросы пока нет, но не ставить их нельзя.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ

Следует отметить, что загрязнение окружающей среды опасно не только ныне живущему поколению, но часто представляет опасность для грядущих поколений, поскольку многие загрязнители мутагенны (или, что почти то же самое, генетически активны). Выявление и устранение генетически активных факторов из среды обитания человека - задача генетической токсикологии, которая представляет собой наиболее активно развивающийся раздел экологической генетики. Это объясняется ее огромным прикладным значением.

Парадоксально, но факт, что открытие индуцированного мутационного процесса потребовало значительных усилий от исследователей: вспомним, что Г.Дж. Меллер получил Нобелевскую премию за открытие мутагенного действия рентгеновых лучей (1927 год). Теперь же мутагены обнаруживаются на каждом шагу. Многие продукты производственной деятельности человека, появляющиеся как результат так называемого технического прогресса, обладают генетической активностью. При этом мы говорим не только об отходах производства. Это могут быть лекарства, консерванты, пищевые добавки и красители, косметика, инсектициды и пестициды, не говоря уже о дыме сигарет и излучениях, сопровождающих "мирный атом", тем более оружие массового уничтожения - ядерное и химическое.

Что же такое генетически активные факторы? В генетической токсикологии принято говорить не только о мутагенах, но и, более широко, о генетически активных факторах. Не всегда удается определить непосредственно мутагенный эффект того или иного воздействия, но можно показать его влияние на кроссинговер, то есть на рекомбинацию генов или индукцию репаративного синтеза ДНК, сопровождающего многие повреждения генетического материала.

Таким образом, мутагенез, рекомбинагенез и индукция репаративного синтеза ДНК - это показатели генотоксичности или генетической активности исследуемого фактора.

Генетически активные факторы делятся на физические, химические и биологические. К физическим факторам относятся температура, ионизирующая радиация, ультрафиолетовый свет, по-видимому, высокочастотное электромагнитное излучение, ультразвук и т.д. Химические генетически активные факторы гораздо труднее поддаются перечислению и классификации. Достаточно сказать, что к ним относятся любые вещества, прямо или косвенно нарушающие структуру и воспроизведение молекул ДНК. Выхлопные газы автотранспорта и выбросы в атмосферу производственных предприятий содержат алкилирующие соединения (их называют радиомиметиками), органические соединения ртути, полициклические углеводороды, обладающие генетической активностью. Многие химические соединения сами по себе не проявляют генетической активности, но их легко активируют внутриклеточные метаболиты, а иногда и соединения, находящиеся в окружающей организм среде. Например, распространенные соли азотной кислоты легко превращаются в нитриты (соли азотистой кислоты) - мутагены, дезаминирующие основания ДНК. В кислой среде желудка млекопитающих нитриты и аминосоединения дают нитрозосоединения - супермутагены, нарушающие репликацию ДНК. Многие вещества, так называемые промутагены, активируются в организме млекопитающих при действии цитохрома P450 . Этот фермент, синтезируемый в печени, относится к классу неспецифических монооксигеназ и предназначен для инактивации чужеродных соединений, попадающих в организм. Но Р450 вместе с тем способен активировать некоторые промутагены. Более того, он может активировать не только промутагены, но и потенциальные канцерогены - вещества, вызывающие рак. Необходимо отметить высокий уровень корреляции между мутагенным и канцерогенным эффектами многих факторов, прежде всего физических и химических. Биологические факторы в этом отношении исследованы меньше всего.

C некоторых пор (у нас с 1979 года) все новые химические соединения (а всего их в обиходе более 4,5 млн) проходят проверку на генетическую активность. Это своеобразная служба генетической безопасности, использующая богатый арсенал различных тест-систем для выявления генетической активности. Эти системы позволяют учитывать мутации генов, их рекомбинации, потери и другие аберрации хромосом, нарушения делений ядра, индукцию репарации ДНК и т.д. При этом используются различные объекты: бактерии, дрожжи и другие низшие грибы, плодовая мушка-дрозофила, растения, культура клеток животных и человека.

Наибольший интерес представляет генетическая активность исследуемых агентов для человека. Поскольку прямое исследование их действия на человека невозможно, приходится ограничиваться результатами, получаемыми на модельных объектах. Эти результаты в значительной степени справедливы и для человека из-за биологической универсальности свойств генетического материала - это всегда ДНК. Тем не менее экстраполяция получаемых результатов на человека всегда представляет некоторые сложности, так как наряду с принципом биологической универсальности следует учитывать и специфику объектов, имеющих свои особенности реагирования на мутагены.

В качестве примера расскажем только об одной тест-системе, получившей широкое распространение при первичном выявлении генетической активности. Это система, разработанная в 60-е годы XX века американским исследователем Б. Эймсом, который длительное время изучал мутации в генах, контролирующих биосинтез гистидина у Salmonella typhimuium. Работа Б. Эймса, прекрасный пример того, как первоначально чисто теоретическое исследование, направленное на выяснение структуры и функции гена, приобрела сугубо практическое значение. Имея в своем распоряжении подробно охарактеризованные мутанты сальмонеллы, нуждающиеся в гистидине, зная молекулярную природу мутационных изменений: замены, вставки или выпадения пар оснований в ДНК гена или более крупные перестройки генетического материала, Эймс предложил изучать реверсии гистидиновых мутантов, то есть восстановление у них способности синтезировать гистидин, и, следовательно расти на среде без гистидина в результате воздействия различных мутагенов.

Тест очень прост: достаточно засеять среду без гистидина мутантом сальмонеллы, нуждающимся в гистидине (который естественно не растет на такой среде), и нанести в центр используемой для этого чашки Петри испытуемое химическое соединение. Через 2-3-е суток можно видеть появление колоний мутантов (в данном случае ревертантов) вокруг пятна нанесенного вещества, если оно обладает генетической активностью (рис. 2). Это пример так называемого спот-теста (от англ. spot - пятно). В настоящее время тест Эймса усовершенствован: наряду с хорошо изученными мутациями потребности в гистидине в геном сальмонеллы вводят делецию по одному из генов репарации, то есть инактивируют этот процесс, тем самым повышают чувствительность бактерии к мутагенам. Вводят также мутацию, блокирующую синтез липополисахаридной капсулы для повышения проницаемости клеток, а также плазмиды, повышающие чувствительность клеток к агентам, усиливающим рекомбинацию. Наконец, испытуемое вещество стали наносить вместе с экстрактом мышиной или крысиной печени, содержащим цитохром Р450 для активации промутагенов. Таким образом, тест-системы для выявления генетической активности могут быть далее усовершенствованы и в значительной степени генетическими методами. С применением теста Эймса впервые были показаны мутагенные эффекты: сигаретного пепла, некоторых пищевых консервантов, красителей для волос и т.д.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ МУТАГЕНЕЗА

Особый интерес представляют биологические генетически активные факторы, поскольку их существование указывает на генетическую активность синэкологических отношений. В конце 30-х годов С.М. Гершензон установил мутагенный эффект ДНК и вирусов. Позже было выяснено, что хромосомные аберрации в соматических клетках вызывают вирусы оспы, кори, ветряной оспы, гриппа, гепатита. Стрептолизин-О, токсин гемолитического стрептококка, повышает частоту мутаций в культуре эмбриональных фибробластов человека. В контроле частота хромосомных аберраций составляет 4,0 ? 0,5%, а при действии токсина - 24,3 ? 0,6%. Ю.Я. Керкис показал мутагенный эффект иммунологического стресса при пересадке и отторжении в силу тканевой несовместимости кожного лоскута у мышей. Мощным мутагеном биологического происхождения оказался афлатоксин - продукт жизнедеятельности плесневого гриба Aspergillus flavus.

Под руководством М.Е. Лобашева еще в 60-е годы на кафедре генетики и селекции Ленинградского университета были начаты эксперименты, доказавшие роль нервной системы в контроле частоты хромосомных аберраций в соматических клетках (роговице глаза) у мышей. Развивая это направление, ученики М.Е. Лобашева показали мутагенный эффект феромонального стресса у мышей. При этом важно, что речь идет уже о мутациях не в соматических, а в генеративных клетках - при сперматогенезе. Схема проделанного эксперимента представлена на рис. 3.

Известно, что запах во взаимоотношениях мышей выполняет функции своеобразного языка. Феромоны, летучие вещества, содержащиеся в моче этих животных, играют роль сигналов, вызывающих реакцию подчинения, агрессии и т.д. Пользуясь этими сигналами, старые самцы держат в подчинении самок и молодых самцов. Оказалось, что запах взрослого самца при однократном воздействии повышает частоту цитологических нарушений в сперматогенезе у молодых самцов, увеличивает частоту аномальных сперматозоидов и доминантных летальных мутаций, выявляемых после их спаривания с самками, не подвергавшимися воздействию. Д.К. Беляев и П.М. Бородин в Новосибирске показали, что стресс у мышей, вызываемый некоторыми физическими воздействиями, повышает у них частоту кроссинговера.

Таким образом, синэкологические отношения, то есть отношения между организмами, могут быть источником наследственной изменчивости и тем самым служить дополнительным фактором эволюции. Эти исследования в последние годы развиваются, к сожалению, недостаточно активно.

27. Моногенные болезни человека

Законы Менделя — это принципы передачи наследственных признаков от родительских организмов к их потомкам, вытекающие из экспериментов Грегора Менделя. Эти принципы послужили основой для классической генетики и впоследствии были объяснены как следствие молекулярных механизмов наследственности. Хотя в русскоязычных учебниках обычно описывают три закона, «первый закон» не был открыт Менделем. Особое значение из открытых Менделем закономерностей имеет «гипотеза чистоты гамет».