93. Рестрикционный анализ, рестрикционные карты, их роль и возможности метода

Рестрикционный анализ — установление мест расщепления ДНК рестриктазами.

Рестрикционная карта — схема молекулы ДНК, на которой указаны места разрезания её различными рестриктазами.

Метод позволяет увидеть крупные генетические изменения, такие как делеции или инсерции. При этом происходит уменьшение или увеличение рестрикционных фрагментов, а также исчезновение или возникновение сайтов рестрикции.

94.Построение рестрикционных карт

Рестрикционная карта (restrictionmap): линейное изображение последовательности ДНК , которое показывает расположение сайтов узнавания специфических рестрикционных ферментов.

Рестрикционные карты строят при исследовании протяженных (до 40 т.п.о.) клонированных последовательностей нуклеотидов, включающих исследуемые гены, .Рестрикционные карты представляют собой схемы, изображающие взаимное расположение сайтов рестрикции для разных рестриктаз и расстояния между ними. Поскольку каждый сайт рестрикции является не чем иным, как строго определенной последовательностью нуклеотидов ДНК, рестрикционные карты заключают в себе информацию об особенностях первичной структуры картируемых участков генома.

Для построения рестрикционной карты используют гибридизацию по методу Е. Саузерна. Клонированный фрагмент ДНК отдельно или в составе вектора получают в препаративном количестве, затем его обрабатывают соответствующими рестриктазами и продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле. Количество образовавшихся рестрикционных фрагментов ДНК, обнаруживаемых после окрашивания бромистым этидием в виде флуоресцирующих полос в ультрафиолетовом свете, соответствует количеству сайтов рестрикции в том случае, если различия в размерах образовавшихся фрагментов ДНК достаточны для их разделения при электрофорезе.

95.Секвенирование днк (энзиматический метод).

    Секвенирование ДНК - набор биохимических методов установления последовательности нуклеотидных оснований ДНК: аденина, гуанина, цитозина и тимина.

МЕТОД СЭНГЕРА

Это наиболее употребительный метод секвенирования ДНК, он позволяет анализировать более крупные фрагменты ДНК с меньшей вероятностью ошибки. Секвенируемую ДНК сначала клонируют в одноцепочечныйбактериофаговый вектор, Одноцепочечная ДНК взаимодействует как субстрат с ДНК-поли-меразой, которая точно копирует первую цепь. Для инициирования этого процесса используют химически синтезированный универсальный нуклеотидный праймер. в результате реакции получаются смеси меченных радионуклидами фрагментов ДНК, один конец у которых одинаков, но при этом они имеют разную длину и разные основания на другом конце. После инкубации ДНК в каждой смеси превращается в одноцепочечную форму. Затем смеси подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Длину и последовательность фрагментов ДНК можно считывать непосредственно с гелевого слоя.

96. Секвенирование ДНК (метод хим гидролиза)

В основе метода секвентированияднк путём хим деградации лежит ограниченооеращепление меченого фрагмента днк под действием специфических реагентов. Условие-меченоеднк только по одному концу. Разделениепродуктов деградации по размеру с помощью элетрофореза в полиакриламидном геле,способного разделять фрагменты днк,различающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид.

основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. Препарат меченной ДНК разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилированиеадениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплениюметиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента.

97. Сравнительный анализ строения гена вирусов, прокариот и эукариот.

Главная количественная особенность генетического материала эукариот – наличие избыточной ДНК. Этот факт легко выявляется при анализе отношения числа генов к количеству ДНК в геноме бактерий и млекопитающих. Если средний размер гена бактерий 1500 пар нуклеотидов (п.н.), а длина кольцевой молекулы ДНК хромосомы Е. coliи В. subtilis составляет свыше 1 мм, то в такой хромо­соме могут разместиться около 3 тысяч генов. Примерно такое число генов было экспериментально определено у бактерий по числу типов иРНК. Если это число умножить на средний размер гена, то получится, что около 95% генома бактерий состоит из кодирующих (генных) последовательностей. Остальные 5%, по-видимому, заняты регуляторными элементами. Иная картина наблюдается у эукариотических организмов. Например, у человека насчитывают приблизительно 50 тысяч генов (имеется в виду только суммарная длина кодирующих участков ДНК – экзонов). В то же время размер генома человека 3×10⁹ (три миллиарда) п.н. Это означает, что кодирующая часть его генома составляет всего 15…20 % от тотальной ДНК. Существует значитель­ное число видов, геном которых в десятки раз больше ге­нома человека, например некоторые рыбы, хвостатые амфибии, лилейные. Избыточная ДНК характерна для всех эукариот. В этой связи необходимо подчеркнуть не­однозначность терминов генотип и геном. Под генотипом следует понимать совокупность генов, имеющих фенотипическое проявление, тогда как понятие генома обозначает количество ДНК, находящееся в гаплоидном наборе хро­мосом данного вида.

 Организация генома прокариот(на примере кишечной палочки)

Основу генетического аппарата кишечной палочки составляет бактериальная хромосома, входящая в состав нуклеоида – ядерноподобной структуры. Нуклеоид по морфологии напоминает соцветие цветной капусты и занимает примерно 30% объема цитоплазмы. Бактериальная хромосома представляет собой кольцевую двуспиральную правозакрученную молекулу ДНК, которая свернута во вторичную спираль. Длина бактериальной хромосомы составляет примерно 4,7 млн. нуклеотидных пар (п.н.), или ~ 1,6 мм. Вторичная структура хромосомы поддерживается с помощью гистоноподобных (основных) белков и РНК. Точка прикрепления бактериальной хромосомы к мезосоме (складке плазмалеммы) является точкой начала репликации ДНК (эта точка носит название OriC). Бактериальная хромосома удваивается перед делением клетки, и сестринские копии распределяются по дочерним клеткам с помощью мезосомы. Репликация ДНК идет в две стороны от точки OriC и завершается в точке TerC. Молекулы ДНК, способные себя воспроизводить путем репликации, называются репликоны.

Геном вирусов включает:

• – Структурные гены, которые кодируют белки. Занимают примерно 95 % вирусной хромосомы. Белки вирусов можно разделить на несколько групп: структурные, ферменты, регуляторы.

• – Регуляторные последовательности, которые не кодируют белки: промоторы, операторы и терминаторы.

• – Прочие некодирующие участки (сайты), в том числе:

• – участок attP, обеспечивающий интеграцию вирусной хромосомы в хромосому клетки–хозяина;

• – участки cos – липкие концевые участки линейных вирусных хромосом, обеспечивающие замыкание линейной хромосомы в кольцевую форму.

Гены, кодирующие рРНК и тРНК, в геноме вирусов обычно отсутствуют. Однако в геноме крупного фага Т4 имеются гены, кодирующие несколько тРНК.

Геном вирусов отличается высокой плотности упаковки информации. Например, у фага φХ174 в пределах одного гена может располагаться еще один ген. В частности, генВ находится в пределах гена А, а ген Е – в пределах гена D. У мелкого РНК-содержащего фага f2 ген регуляторного белка, блокирующего лизис (созревание вирионов и разрушение клетки), перекрывается с двумя другими генами, удаленными друг от друга.

98. Мозаичные гены. Интроны. Экзоны.

Диагностировать мозаицизм, который мы ранее обозначили как сочетание клеток с нормальными и аномальными хромосомами, чрезвычайно трудно. Пораженные индивиды весьма различны в зависимости от того, какие органы у них затронуты. Часто встречаются родители, внешне вполне нормальные, которые имеют детей с аномальными половыми хромосомами. один из родителей «мозаичен» по такой же, как у ребенка, хромосомной аномалии, но поскольку клетки его жизненно -важных органов нормальны, он кажется не пораженным болезнью.

Интроны.

Не следует путать с интронизацией — общественным богослужением.

Интрон — участок ДНК, который является частью гена, но не содержит информации о последовательности аминокислот белка.

Последовательность нуклеотидов, соответствующая интрону, удаляется из транскрибированной с него РНК в процессе сплайсинга до того, как произойдёт считывание белка (трансляция). Интроныхарактерны для всех типов эукариотической РНК, но также найдены в рибосомальной РНК (рРНК) и транспортной РНК (тРНК) прокариот. Число и длина интронов очень различны в разных видах и среди разных генов одного организма. Например, геном рыбы фугу (Takifugu rubripes) содержит мало интронов. С другой стороны, гены млекопитающих и цветковых растений часто содержат многочисленные интроны, которые могут быть длиннее экзонов.

Экзон-участок гена, несущий информацию о первичной структуре белка. В гене экзоныразделенынекодирующими участками — интронами.

Или это последовательность ДНК, которая обычно представлена в зрелой РНК. При альтернативномсплайсинге некоторые экзоны удаляются из зрелой РНК.

99. Перекрывающиеся гены.

На одном и том же участке ДНК иногда может быть записана информация о двух совершенно разных РНК и, соответственно, о совершенно разных белках. Такое явление получило название перекрывания генов. То есть за счёт сдвига рамки считывания трансляция может начинаться с разных нуклеотидных последовательностей. Соответственно, при трансляции мРНК образуются совершенно разные белки.

100. Структура лактозного оперона E. coli, регуляция его генетической активности.

Механизм регуляции генетического кода был открыт французскими учеными ФЖакобом и ЖМоно в 1961 г. на бактериях E.coli и получил название механизма индукции-репрессии. Было установлено, что синтез соответствующих белков - ферментов индуцируется веществом, служащим субстратом для данного фермента и необходимым для нормальной жизнедеятельности клетки.

Так, например, для нормальной жизнедеятельности E.coliнеобходим молочный сахар (лактоза) и в ее геноме содержатся гены, контролирующие синтез ферментов, гидролизующих лактозу до простых соединений. Если среда, в которой находятся бактерии, лактозы не содержит, эти гены пребывают в репрессированном состоянии и не функционируют. Внесенная в среду лактоза будет тем индуктором, который включает в работу данные гены, и в клетке начинается синтез ферментов, гидролизующих лактозу до более простых соединений. После удаления лактозы из среды синтез этих ферментов прекращается.

Роль репрессора может выполнять и вещество, синтезируемое в клетке, если содержание его превышает норму. Например, если синтезируются нуклеотиды, аминокислоты и другие вещества и содержание их превышает количество, необходимое данной клетке, каждое из них может быть репрессором и подавлять работу генов, синтезирующих ферменты, необходимые для данного биохимического процесса.

По теории Жакоба и Моно, гены, влияющие на синтез определенного фермента или белка, расположены в молекуле ДНК последовательно друг за другом в порядке их влияния на ход реакции синтеза. Такая группа генов называется опероном, а гены, непосредственно кодирующие синтез соответствующих ферментов, называют структурными генами. В начале каждого оперона находится специальный ген — ген оператор. На структурных генах одного оперона обычно образуется одна м-РНК, и эти гены бывают одновременно активны или неактивны. Как правило, структурные гены в опероне находятся в состоянии репрессии.