2.2.2. Флуоресцентный анализ клеточного дыхания обонятельных клеток

Митохондриальное дыхание в обонятельных клетках исследовали методом прижизненной люминесцентной микроскопии изолированной обонятельной выстилки лягушки. Методы люминесцентного анализа позволяют изучать физико-химические процессы, протекающие непосредственно в живой клетке и ее органоидах. В отличие от методов, используемых в классической биохимии, здесь в качестве объекта исследования выступают макромолекулярные системы, выполняющие определенные функции в неразрушенной живой клетке, а также в клетках in situ. Причем изменения интенсивности собственной люминесценции отражают динамику концентрации определяемых веществ в ходе тех или иных изменений функционального состояния препарата. Среди физико-химических процессов в клетке существенную роль могут играть изменения тканевого дыхания (Карнаухов, 1972; 1976; 1978), которые могут быть связаны с актом рецепции, в том числе и обонятельной.

По сравнению с изолированными митохондриями функции в клетке организованы гораздо сложнее, в условиях in situ сохраняются процессы переключения путей метаболической регуляции, за которыми можно проследить по динамике изменений люминесценции переносчиков электронов по электрон-транспортной цепи митохондрий. Посредством анализа собственной флуоресценции можно решать проблемы, связанные с внутриклеточной регуляцией обмена веществ и энергии (Карнаухов, 1976). В свою очередь, реакции дыхательной цепи – терминального этапа биологического окисления, являются интегральным показателем динамики обмена веществ. Он раньше других отзывается на изменения метаболической активности клетки (Chance, Conndly, 1957; Giacobini et al., 1963; Зинченко, 1972; Карнаухов, 1971; 1977). Этот метод позволяет изучать биохимические реакции клеток на адекватные раздражители. Среди этих реакций существенную роль могут играть изменения активности дыхательной цепи митохондрий, связанные с актом рецепции (Соловьев, Самойлов, 1977 а, б; Самойлов, 1983).

Биологической основой применения метода люминесцентного анализа к изучению взаимодействия энергетических систем клетки с ее функциональными механизмами является то, что многие ферменты и коферменты, входящие в системы окислительного метаболизма, обладают характерными спектрами поглощения и люминесценции в окисленном и восстановленном состоянии (Карнаухов, 1976).

Флуоресценция живых клеток и тканей в диапазоне длин волн от 400 до 600 нм определяется главным образом свечением восстановленных пиридиннуклеотидов (НАДН) и окисленных флавопротеидов (ФП) (Chance et al., 1965; Карнаухов, 1977). Они являются коферментами дегидрогеназ, поставляющих электроны и протоны в дыхательную цепь митохондрий, согласуя ее с циклом Кребса и другими ферментативными системами (Ленинджер, 1985; Cecchini, 2003).

В литературе накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о тесной корреляции реализации специфической клеточной функции с клеточным дыханием и окислительно-восстановительным состоянием электронных переносчиков (Chance, Connely, 1957; Пильщик и др., 1964; Chance et al., 1965; Chance, Schoener, 1966; Bull, Lutkenhoff, 1973). Соотношение окисленных и восстановленных форм компонентов окислительного метаболизма определяется функциональной активностью клетки. Переход из состояния покоя в состояние активного обмена сопровождается изменением окислительно-восстановительного состояния дыхательной цепи митохондрий, что свидетельствует о разном метаболическом состоянии энергосистем клетки (Карнаухов, 1976).

Максимум интенсивности собственной флуоресценции НАДН находится в синей области спектра, приходящейся на область от 455 до 480 нм. При окислении пиридиннуклеотиды теряют способность люминесцировать. Известно, что в клетке существуют различные пулы НАДН, вносящие свой вклад в люминесцентный сигнал. Суммарная интенсивность свечения в этой области определяется вкладами НАДН и НАДФН, соотношение которых не эквимолярно (Scholz et al., 1969; Estabrook, 1962). В нервной ткани и мышцах животных стационарная концентрация НАДН в 4 раза выше, чем НАДФН (Glock, Lean, 1955; Lowry et al., 1957; Giacobini, Grasso, 1966). Показано, что квантовый выход собственной флуоресценции НАДФН в 4 раза ниже, чем НАДН (Jobsis, Duffield, 1967). В опытах на изолированных митохондриях печени (Avi-Dor et al., 1962) и перфузируемой печени установили, что изменения интенсивности синего свечения отражает окислительно-восстановительное состояние НАДН и практически не зависит от НАДФН. Поэтому вкладом НАДФН в флуоресцентный сигнал в области 455 – 480 нм можно пренебречь.

Не менее важно оценить вклад гликолитического и митохондриального НАДН в суммарную флуоресценцию. Согласно имеющимся экспериментальным данным, вклад второго пула в общий сигнал почти в 10 раз выше, чем цитоплазматического (Avi-Dor et al., 1962; Jobsis, Duffield, 1967), и это соотношение увеличивается в 50 раз в нервной ткани (Doane, 1967). Можно полагать, что и в обонятельных клетках, являющихся модифицированными нейронами, синюю флуоресценцию обеспечивают главным образом митохондриальный никотинамидадениндинуклеотид (пиридиннуклеотид).

Среди флавопротеидов основное внимание уделяется прежде всего производным рибофлавина: флавинмононуклеотиду (ФМН) и флавинадениндинуклеотиду (ФАД). Оба флавиновых нуклеотида отличаются от приридиннуклеотидов тем, что прочно связаны с белком и называются флавопротеидами. Они переносят электроны от субстрата к рибофлавиновому компоненту кофермента. Наиболее интересным из них являются сукцинат- и НАДН-дегидрогеназы. Второй фермент катализирует восстановление своего флавинового кофермента восстановленным пиридиннуклеотидом.

Окисленным флавопротеидам (ФП) свойственна собственная флуоресценция на длине волны 520 – 530 нм, которая обусловлена рибофлавином. При восстановлении флавопротеиды теряют способность люминесцировать (Thorell, Chance, 1959). Редокс-переходы ФП относятся только к одному пулу, так как их флуоресценция на 90% обеспечивается митохондриальными фракциями (Chance, Schoener, 1966; Scholz et al., 1969; Лукьянова и др., 1982). Преобладание в суммарной флуоресценции митохондриальных пулов НАДН и ФП обеспечивает при исследовании собственной флуоресценции живой ткани получение данных о функционировании дыхательной цепи – системы терминального окисления, встроенной во внутреннюю мембрану митохондрий.

Для исследования собственной флуоресценции НАДН и ФП в обонятельных клетках препарат изолированной выстилки инкубировали в растворе Рингера (рН 7,33) в течение 40 – 45 минут. Достаточно длительный срок инкубации связан с тем, что в свежеприготовленных препаратах изменены их функциональные свойства. В частности, в них снижена концентрация АТФ, нарушено ионное равновесие. Для ранних сроков после приготовления характерно ослабление степени энергизации. Стабилизация наступает через 40 – 60 минут (Лукьянова и др., 1982).

После инкубации выстилку размещали под объективом люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ – Р8 (рис. 2). Преимущество метода возбуждения люминесценции, при котором один и тот же высокоапертурный микрообъектив используется и для концентрирования возбуждающего излучения на объекте и для отведения люминесцентного излучения этого объекта заключается в максимально высокой яркости светового сигнала, отводимого от люминесцирующего объекта, которая пропорциональна четвертой степени апертуры микрообъектива. Например, при увеличении апертуры объектива х10 от 0,2 до 0,4 яркость флуоресценции, отводимой от препарата, увеличивается в 16 раз при прочих равных условиях (Карнаухов, 1978). Это позволяет подобрать такой режим возбуждающего света, при котором его влияние на функциональное состояние объекта минимально.

Достоинством микроскопа ЛЮМАМ-Р8 является то, что он позволяет одномоментно измерять собственную флуоресценцию НАДН и ФП в реальном времени. Излучение этих компонентов дыхательной цепи, проходя через монохроматор и свой фотоэлектронный умножитель, усиливается и преобразовывается в электрические сигналы, которые регистрируются на компьютере.