Молекулярна активність деяких ферментів (за в.Й. Розенгартом)

Фермент	Число молекул субстрату, що перетворюється однією молекулою ферменту за 1 хв
Карбоангідраза	36 000 000
Кетостероїдізомераза	17 100 000
Амілаза	1 100 000
Ацетилхолінестераза	3 000 000
b-Галактозидаза E. соlі	12 500
Фосфоглюкомутаза	1 240
Сукцинатдегідрогеназа	1 150

Із даних таблиці видно, що перше місце за активністю займає карбоангідраза, яка за 1 хв перетворює 36 млн молекул субстрату (вугільної кислоти). Це найактивніший (із усіх нині відомих) фермент.

Якщо фермент має простетичну групу або каталітичний центр, концентрація яких доступна вимірюванню, то його каталітичну дію можна виразити у величинах активності каталітичного центру, тобто, числом молекул субстрата, які перетворюються за 1 хв одним каталітичним центром.

Оборотність дії ферментів. Ферменти здатні впливати на синтез субстрата і на його розпад. Так, пепсин при рН=0,5 – 2 розщеплює білки до поліпептидів, пептидів і амінокислот. При рН=5 – 6 з цих же амінокислот під впливом пепсину синтезуються білки. Значення оборотності дії ферментів велике. Воно дає можливість організму економно витрачати пластичні і енергетичні матеріали, клітинам і тканинам одержувати потрібні біологічні речовини залежно від потреб у певні періоди існування і функціонування. Так, в анаеробній фазі розщеплення вуглеводів глікоген або глюкоза розпадаються до молочної або піровиноградної кислот. Близько ⅔ цих кислот регенерується до глюкози і глікогену під впливом тих же ферментів, які здійснювали розпад.

Хімічна природа ферментів

Відомо, що ферменти мають білкову природу. Як і білки, їх ділять на прості і складні. Прості ферменти є однокомпонентними, а складні – дво- і багатокомпонентними.

Для ферментів-білків характерна будова, типова для цього класу сполук. Для ряду ферментів була визначена первинна, вторинна, третинна і четвертна структура молекули. Так, встановлена послідовність амінокислотних залишків в молекулі панкреатичної РНК-ази, лізоциму, хімотрипсина, аспартатамінотрансферази й ін. У більшості ферментів молекула складається з одного поліпептидного ланцюга, що має вигляд a- і b-спіралей. Вивчена третинна і четвертна структури ферментів. Третинна і четвертна структури ферменту визначають характер його функцій. Так, якщо молекула має 12 субодиниць, то фермент здійснює реакцію декарбоксилування (піруватдекарбоксилаза), шість субодиниць – фермент каталізує окисно-відновні перетворення пірувата та ін.

Молекули ферментів зазвичай мають великі розміри і складну просторову конфігурацію. Кожна частина молекули ферменту строго спеціалізована. Так, в молекулі ферменту є активний центр. Він є динамічним утворенням, що містить у собі оптимальне розміщення різних функціональних груп і угрупувань, які забезпечують акт каталізу. Молекули трипсину і карбоксипептидази мають по одному активному центру, гліцеральдегід-фосфат-дегідрогенази – 2, уреази – 3 – 4, холінестерази – 20 – 100. В активному каталітичному центрі виділяються спеціалізовані ділянки, що відповідають за зв’язок з субстратом – контактна, або „якірна” ділянка (рис. 5).

Рис. 5. Схема молекули ферменту (за О.С. Хохловим і Ю.О. Овчинниковим)

Периферійні частини молекули ферменту беруть участь в підтримці і формуванні просторової конфігурації активного центру, визначають внутрішньоклітинну локалізацію ферменту і його активних центрів, взаємостосунки з клітинними мембранами і органоїдами клітини та ін. У молекулі ферменту є ділянки, з якими можуть взаємодіяти інші речовини – алостеричні активатори або інгібітори, що змінюють просторову конфігурацію і каталітичну активність всього ферменту і його активних центрів.

Активний центр ферментів. Вивчення специфічності і каталітичної дії ферментів дало можливість встановити, що субстрат зв’язується не з усією молекулою ферменту, а з окремою її ділянкою, яка називається активним центром (рис. 5). Оскільки активний центр визначає специфічність і каталітичну активність ферменту, то він повинен складатися із структури певного ступеня складності, яка може зближуватися і взаємодіяти з молекулою субстрату.

У складних ферментах (протеїдах) активний центр утворений кофактором і залишками амінокислот; у простих ферментах (протеїнах) активний центр представлений певною комбінацією залишків амінокислот, які розміщені на відповідній ділянці молекули ферменту. До складу активного центру більшості простих ферментів входять залишки амінокислот цистеїна, серина, аргініна, аспарагінової і глутамінової кислот, гістидина, тирозина і триптофана. Серед них важливе значення мають групи HS (цистину), групи OH (серину), імідазольне кільце гістидину. Певну роль відіграють функціональні групи інших залишків амінокислот, зокрема карбоксильні групи аспарагінової і глутамінової кислот та індольна група триптофану. При цьому необхідно зауважити, що такі функціональні групи розміщені в поліпептидних ланцюгах ферменту на різній відстані одна від одної. Їх зближення з утворенням активного центру відбувається тільки внаслідок формування властивої для ферменту вторинної і третинної структур. Отже, активний центр ферменту складається із функціональних груп, які відповідно зорієнтовані у просторі. Порушення третинної і вторинної структур призводить до зниження або повної втрати активності ферменту. Це можна спостерігати при дії на ферменти високої температури, тобто коли відбувається їх денатурація, яка супроводжується деформацією структури білка.

Деякі ферменти мають два і більше активних центри. В активному центрі розрізняють так звану каталітичну ділянку, яка безпосередньо взаємодіє з субстратом, і контактну (якірну) ділянку, яка зумовлює спорідненість до субстрату, формування його комплексу з ферментом.

Такий поділ активного центру ферменту є досить умовним, оскільки взаємодія в контактній ділянці фермент-субстратних сполук значною мірою впливає на швидкість перетворень, які відбуваються на каталітичній ділянці ферменту. Умовний характер має також і саме відділення активного центру від інших частин ферменту, оскільки вони мають важливе значення в утворенні його нативної структури і впливають на реакційну здатність функціональних груп активного центру. Отже, за каталітичну активність ферменту відповідає вся структура його молекули.

В ході каталітичного акту відбувається своєрідна індукційна „підгонка” субстрата (іноді і інгібітору) до активного центру (рис. 6).

Рис. 6. Схема індукованої „підгонки” ферменту і субстрату, ферменту й інгібітору

Крім активного центру в молекулі ферменту може бути також алостеричний центр (центри) (від грец. алос – другий, інший і стереос – просторовий, структурний). Алостеричний центр – це ділянка молекули ферменту, яка в результаті приєднання до неї низькомолекулярної сполуки зумовлює зміну просторової (третинної), а іноді і четвертинної структури ферменту. Це, в свою чергу, призводить до зміни конфігурації активного центру, що зумовлює зміну каталітичної активності, тобто підвищує або знижує каталітичну активність. Цей процес є основою так званої алостеричної регуляції ферментативної активності. Ферменти, активність яких контролюється станом активного та алостеричного центрів, називаються алостеричними ферментами. Характерною особливістю цих ферментів є наявність у молекулі олігомерного ферменту декількох активних і алостеричних центрів. Функціональна активність цих центрів тісно взаємозв’язана між собою і структурою усієї молекули ферменту.

Прості ферменти. Молекули простих ферментів при гідролізі розщеплюються до амінокислот. За хімічними властивостями прості ферменти відносяться до альбумінів (естераза печінки), глобулінів (трипсин і уреаза) та до інших груп простих білків. Простими ферментами є гідролази харчового каналу (трипсин, уреаза, РНК-аза, ДНК-аза, хімотрипсин), лізоцим яйця, алкогольдегідрогеназа дріжджів і печінки та ін. У простих ферментів активний центр зазвичай формується із залишків гістидина, серина, аргініна, триптофана, цистеїна, аспарагінової і глутамінової кислот, тирозина. Так, в активному центрі РНК-ази розміщені два залишки гістидина, залишок аспарагіна і лізину. При формуванні третинної структури ферменту в його молекулі утворюється своєрідна „кишеня” поліпептидного ланцюга, в якій і відбуваються каталітичні перетворення субстрата (рис. 5).

Складні ферменти. Більшість ферментів є складними білками. При діалізі білковий компонент (апофермент) залишається в діалізаторі, небілковий проходить через напівпроникну перегородку. За присутності небілкових компонентів (кофакторів) виявляється каталітична дія багатьох ферментів. M. Діксон і Е. Уебб всі кофактори ферментів розділили на три види: коферменти, простетичні групи і активатори. Ні кофактор, ні апофермент не можуть самостійно повноцінно здійснювати каталітичний акт. Так, при з’єднанні заліза з молекулою порфірина утворюється гем, його каталітична активність щодо розкладання пероксида водню зростає в 1000 разів, а після приєднання гема до специфічного білкового компоненту утворюється каталаза, каталітична активність її в 100 000 000 разів перевищує активність кофактора. Кофактор в середньому складає близько 1 % загальної маси ферменту.

Зв’язок між апоферментом і кофактором в молекулі різних ферментів неоднаковий. Часто кофактор неміцно зв’язаний з апоферментом і з’єднується з ним під час каталітичного акту. В цьому випадку кофактор є типовим коферментом (див. вище). Прикладом таких ферментів є дегідрогенази. В багатьох ферментах кофактор міцно і постійно зв’язаний з апоферментом – простетична група, наприклад каталаза і пероксидаза, які містять гем. До активаторів ферментів відносять такі кофактори, які переводять фермент в активний стан, але самі не беруть участь в каталітичному акті. До них відносяться багато неорганічних іонів. До ферментів такого роду можна віднести карбоксипептидазу, карбоангідразу та ін. Їх часто називають металоферментами.

Розподіл кофакторів на три види умовний, оскільки дуже часто важко провести чітку грань між коферментом і простетичною групою, між іонами металів що входять до складу молекули та іонами, що активують каталітичний процес.

Функції кофакторів різноманітні. Перш за все, вони є основою для формування активного центру і здійснення контакту молекули ферменту з молекулами субстрата. Вони беруть участь у перенесенні атомних груп, атомів, протонів і електронів у ході каталітичного процесу. Деякі з них виконують зв’язуючі функції між різнорідними ферментами, забезпечуючи узгодженість їх дії. Каталіз здійснює вся молекула ферменту. Її білкова частина обумовлює швидкість реакції і специфічність дії. Один і той же кофактор може бути складовою частиною багатьох ферментів, різних за своєю будовою і значенням. Так, фосфопіридоксаль є кофактором понад 30-ти ферментів, що здійснюють карбоксилування, транс- і переамінування.

В молекулах складних ферментів в утворенні активного центру бере участь відповідний кофактор і деякі прилеглі до нього білкові функціональні групи: SH-група цистеїна, ОН-група серина, імідазольне кільце гістидина, СООН-групи аспарагінової і глутамінової кислот, індольна група триптофана та ін.

Коферменти. Простетичні групи

Коферментами називають низькомолекулярні органічні сполуки небілкової природи, що володіють здатністю оборотно зв’язуватися з ферментним білком. Їх можна відділити від апофермента діалізом, дією кислот або лугів, пропусканням через колонку з сефадексом. Утворення молекули ферменту з апо- і коферментів відбувається за рахунок слабих електростатичних або вандерваальсових сил. При цьому змінюється вторинна і третинна структури молекули, після чого фермент-білок стає більш стійким до денатуруючих чинників, ніж апофермент. Коферменти в активному центрі виконують роль переносника різних функціональних груп, протонів і електронів. Окремі коферменти беруть участь в активації молекул субстратів. Коферменти, відщеплюючись від апофермента, здійснюють транспортування цих речовин між окремими ферментами ферментативного ланцюга, перерозподіл їх між органоїдами і гіалоплазмою. В ході каталітичного акту коферменти зазвичай не зазнають глибоких хімічних змін і можуть багато разів (у складі одного або декількох ферментів) брати участь у ферментативних реакціях.

Більшість коферментів є похідними вітамінів. Хімічна природа кофермента значною мірою визначає тип і механізми реакцій які вони каталізують. Недостатня кількість вітаміну в раціоні викликає гальмування тих реакцій обміну речовин, в яких бере участь фермент.

Найбільш поширені такі коферменти.

Нікотінамідаденіндинуклеотид (НАД). Цей кофермент відноситься до універсальних по розповсюдженню і біологічній ролі. Містить каталітично активне угрупування – амід нікотинової кислоти. Структура НАД була вивчена О. Варбургом і X. Ейлером у 1936 р. НАД є складовою частиною понад 40 різних дегідрогеназ:

Сировиною для отримання НАД зазвичай служать дріжджі.

Нікотинамідаденіндинуклеотид фосфат (НАДФ). Цей кофермент відрізняється від НАД наявністю третього залишку фосфорної кислоти в положенні 2¢ рибози аденілової частини молекули.

НАДФ входить до складу меншого числа ферментів, ніж НАД. НАД в тканинах в 5 – 10 разів більше, ніж НАДФ. НАД і НАДФ є першою ланкою в ланцюзі проміжних переносників водню при біологічному окисленні.

Ліпоєва кислота. Є коферментом багатьох оксидоредуктаз. Зв’язується з апоферментом через карбоксильну групу і аміногрупу залишку лізину:

Коферментна функція ліпоєвої кислоти в активному центрі ферменту обумовлена здатністю легко окислюватися і відновлюватися з утворенням дисульфідних зв’язків або сульфгідрильних груп:

Це і дає можливість ферментам, що містять ліпоєву кислоту, брати участь як в перенесенні ацильних груп, так і реакціях біологічного окислення.

Глутатіон. Один з найпоширеніших природних пептидів. Трипептид глутатіон утворений із залишків трьох амінокислот: глутамінової, цистеїна і гліцина (g-глутамініл-цистеїніл-гліцин):

Ним багаті печінка, наднирники та еритроцити (75 – 120 мг%). Значення глутатіона в активному центрі ферментів обумовлено наявністю SH-груп, які легко вступають в реакцію окислення з аналогічними групами субстрата або сусідньої ділянки ферменту, утворюючи дисульфідні зв’язки:

В одних випадках це дає можливість ферменту фіксувати субстрат, в інших – одержувати для окисно-відновних реакцій протони і електрони і т.д. Відновлений глутатіон є коферментом деяких ізомераз, що здійснюють перетворення кетоформ кислот в енольні, циc-ізомерів кислот в транс-ізомери та ін. Деякі ферменти (фосфогліцерин-альдегід-дегідрогеназа) містять глутатіон у вигляді простетичної групи. Глутатіон служить коферментом при дії катепсинів, папаїна та ін. Зараз відомо понад 100 ферментів, що містять тіолові групи. Вважають, що глутатіон входить до складу молекули ферменту у відновленій формі.

Кофермент А (KoA). KoA – похідне аденілової, фосфорної, пантотенової кислот і b-меркаптоетаноламіна:

Наявність SH-групи у складі молекули кофермента дає йому можливість легко взаємодіяти з жирними кислотами, утворюючи ацилпохідні. KoA іноді називають коферменгом ацилування, або ацетилювання. Відомо понад 70-ти ферментів, у молекулі яких є KoA. Ацетил-КоА бере участь в реакціях перенесення, оксидоредукції, ізомеризації, конденсації і розщепленні ацильних груп.

Убіхінони. Ці коферменти, близькі по будові до вітаміну К, є похідними 5-метил-2,3-диметоксіхінона, в молекулі якого до шостого атома вуглецю приєднується поліізопреновий ланцюг (n = 6– 10):

Біологічне значення убіхінонів основане на їх здатності до оборотних окисно-відновних перетворень як проміжних сполук між флавопротеїдами і цитохромами. В ліпідному шарі біологічних мембран їх в 6 – 10 разів більше, ніж цитохромів.

2-Оксоглутарат. Цей метаболіт може виконувати коферментні функції. Складає єдину систему з глутаміновою кислотою в перенесенні аміногрупи трансаміназами:

Нуклеозидфосфати. Ці коферменти беруть участь в реакціях трансфосфорилування і передачі енергії від одного процесу до іншого. Реакції каталізуються кіназами. У ролі коферментів виступають найчастіше такі нуклеозидфосфати: АМФ, АДФ, АТФ, ГМФ, ГДФ, ГТФ, ЦТФ, УМФ, УДФ і інші і, перш за все, АДФ і АТФ.

Вони є, з одного боку, джерелами хімічної енергії, яка необхідна для протікання хімічних реакцій, з іншого – складовими частинами багатьох ферментів і коферментів.

Зокрема, АТФ є коферментом ряду кіназ, які переносять залишок фосфорної кислоти на монози:

АТФ також може бути джерелом пірофосфата для деяких вуглеводів:

АТФ часто виступає в ролі кофермента при перенесенні аденозинмонофосфорного залишку на яку-небудь кислоту, зокрема, на амінокислоту:

АТФ – джерело аденозильного залишку при активації і перенесенні метильних груп.

Як коферменти часто виступають уридинфосфати і їх похідні. Наприклад, УДФГ використовується при активації, перенесенні і перетворенні цукрів: ізомеризації галактози в глюкозу, синтезі сахарози, лактози, глюкозидів, хітину і т.д.

Коферментні функції виконують і інші нуклеозидфосфати. Зокрема, з участю цитидинфосфатів протікають реакції синтезу окремих видів фосфатидів, особливо лецитину.

Тетрагідрофолієва кислота (ТГФК). Це гомолог фолієвої кислоти, у якої відновлені атоми водню і азоту в положеннях 5, 6, 7 і 8:

ТГФК є коферментом великої групи трансфераз, що каталізують реакції, пов’язані з перенесенням або активацією одновуглецевих залишків: –СОН, –СН₂–ОН, –СН₃. З участю ТГФК синтезуються і розщеплюються пуринові основи і деякі амінокислоти: гістидин, гліцин і, особливо, серин.

B₁₂-залежні коферменти. Ці коферменти є похідними вітаміну В₁₂ в молекулі якого ціаниста група заміщена на 5¢-дезоксиаденозин. Кофермент B₁₂ разом з тетрагідрофолієвою кислотою бере участь в перенесенні метильних груп. Під впливом відповідної метилтрансферази від 5-метилтетрагідрофолієвої кислоти метильна група переноситься на кофермент B₁₂ і приєднується до його молекули замість 5¢-дезоксиаденозина. Потім під впливом іншої трансферази ця ж метильна група переноситься на речовину, яка необхідна для синтезу метилвмісної сполуки. Ним може бути гомоцистеїн, з якого утворюється амінокислота метіонін. Після метилування вітамін B₁₂ знову перетворюється в кофермент B₁₂ і вступає в реакцію з новими порціями 5-метилтетрагідрофолієвої кислоти. Крім того, кофермент B₁₂ бере участь в найважливішій для біосинтезу жирних кислот реакції – ізомеризації сукциніл-КоА в метилмалоніл-КоА:

Кофермент B₁₂ бере участь в ізомеризації глутамінової кислоти, перетворенні діолів у альдегіди та в інших важливих реакціях обміну речовин.

Простетичні групи. Багато ферментів у складі своїх молекул містять кофактори, які міцно зв’язані ковалентними зв’язками з апоферментами. Молекули таких ферментів слабо або зовсім не дисоціюють. При утворенні молекули ферменту з апофермента і простетичної групи утворюється стійка вторинна і третинна структура. З кофакторів такого роду найбільший інтерес представляють такі:

Флавіннуклеотиди. Флавіннуклеотиди – це похідні вітаміну B₂, або рибофлавіну. В тваринних клітинах зустрічаються в основному флавінмононуклеотиди (ФМН) і флавінаденіндинуклеотиди (ФАД):

ФМН і ФАД – простетичні групи флавінових ферментів, або флавопротеїдів. Зокрема, ФМН як простетична група, з’єднуючись з апоферментом, утворює холофермент – „жовтий дихальний фермент” (ЖДФ):

Ізоалоксазонове угрупування простетичної групи дає можливість ЖДФ виконувати найважливіші каталітичні функції, зокрема, брати участь в реакціях біологічного окислення. ЖДФ є переносником протонів і електронів в двох напрямах: у бік цитохромів або від цитохромів до піридиннуклеотидів дихального ланцюга і до окислених субстратів. Крім того, флавіннуклеотиди беруть участь у ряді інших реакцій обміну речовин. Серед них особливе місце займають реакції утворення подвійних зв’язків. Зокрема, сукцинатдегідрогеназа і ацил-КоА-дегідрогеназа циклу b-окислення жирних кислот каталізують процеси, пов’язані з утворенням подвійних зв’язків:

Тіамінфосфати. Тіамінфосфати є похідними вітаміну В₁ або тіаміну. Простетичною групою ферментів найчастіше виступає тіамінпірофосфат (ТПФ). З’єднання тіамінфосфатів з апоферментами, мабуть, таке ж, як і флавіннуклеотидів. Каталітична активність ферменту пов’язана з іонізацією вуглецевого атома в положенні 2 тіазолового кільця, до яких і приєднується молекула субстрата:

Під впливом позитивного заряду атома азоту від вуглецевого атома в положенні 2 відщеплюється протон, виникає негативно заряджений карбаніон. Карбаніон – нуклеофільний центр, який легко вступає в реакцію з субстратом, наприклад, з піровиноградною кислотою, утворюючи піруват-ТПФ-комплекс. Цей комплекс легко декарбоксилується, утворюючи альдегідо- або кето-ТПФ-комплекс, карбонільна група якого передається на відповідний акцептор, наприклад, на ліпоєву кислоту.

ТПФ після цього вступає в реакцію з новими порціями субстрата. ТПФ є простетичною групою не тільки піруватдекарбоксилази, але й інших ферментів, що беруть участь в обміні багатьох a-кетокислот, утворенні і розщепленні кетоцукрів, a-оксикетонів і дикетонів.

Піридоксальфосфат і піридоксамінфосфат – похідні вітаміну В₆. Є складовою частиною піридоксалевих ферментів. Значення цих ферментів у білковому обміні велике, оскільки з їх діяльністю пов’язана більшість перетворень a-амінокислот: переамінування, декарбоксилування, рацемація, конденсація b- і g-заміщених a-амінокислот і т.д. Теорія каталітичної дії цих ферментів вперше була розроблена радянськими біохіміками О.E. Браунштейном і M.M. Шемякіним на прикладі реакцій переамінування:

Ці реакції дають можливість організму отримати потрібні замінні амінокислоти для клітин і тканин. Крім того, окремі декарбоксилази, що містять в своїх молекулах піридоксальфосфат або піридоксамінфосфат, каталізують утворення в тканинах фізіологічно активних амінів: гістаміна з гістидина, серотоніна з триптофана та ін. З діяльністю піридоксалевих ферментів пов’язано утворення цистеїна з серина і гомоцистеїна, тирозина, триптофана.

Біотин. Приєднання біотина до апоферменту здійснюється за допомогою пептидного зв’язку, який утворюється за рахунок карбоксильної групи біотина і e-аміногрупи залишку лізину простого білка. Біотин входить до складу молекул багатьох ферментів, що каталізують реакції карбоксилування і перенесення карбоксильних груп.

Залізопорфіринові комплекси є простетичною групою каталази, пероксидази і цитохромів. У каталазі і пероксидазі, як і в гемоглобіні крові, простетична група – гем. Залежно від природи гема цитохроми ділять на чотири групи:

1. Цитохроми А – містять залізоформілпорфірин.

2. Цитохроми В – містять залізопротопорфірин.

3. Цитохроми С – містять заміщений залізомезопорфірин з ковалентними зв’язками між білком і порфірином.

4. Цитохроми D містять залізодигідропорфірин. Апоферменти – низькомолекулярні білки.

Кожна група цитохромів складається з індивідуальних представників. Вони позначаються малими латинськими буквами і цифровими підрядковими індексами: а, a₁, а₂, в, в₁, в₂ і т.д.

Зв’язок між апоферментом і простетичною групою найчастіше ковалентний і додатковий. Прикладом може бути цитохром с:

Цитохроми є складовою частиною дихального ланцюга. В ході функціонування якого електрони послідовно переносяться від „жовтого дихального ферменту” на цитохром b, c₁, c, а і а₃. Під впливом ферменту, цитохромоксидази цитохром а окислюється, електрон, що відщепився, переноситься на атом кисню, який іонізується і реагує з іоном водню. Утворюється вода. Енергія акумулюється у вигляді АТФ.

Ізоферменти

Ізоферменти – це різновиди ферменту, які володіють однією і тією ж субстратною специфічністю, але відрізняються між собою деякими фізичними, хімічними, каталітичними та імунологічними властивостями. Молекула ізофермента складається з декількох субодиниць, які формують її четвертну структуру. В даний час відомі ізоферменти декількох ферментів: лактатдегідрогенази (ЛДГ), фосфоглюкомутази, альдолази, креатинкінази, малатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, фосфоглюконатдегідрогенази та ін.

Найбільш детально вивчені ізоферменти ЛДГ, яка здійснює перетворення молочної і піровиноградної кислот. Молекулярна маса ЛДГ складає 140 тис. Її молекула складається з чотирьох субодиниць, які діляться на два види: H (переважають в міокарді) і M (найбільше в скелетній мускулатурі). Для ЛДГ тварин характерні п’ять ізоферментів, що складаються з таких субодиниць: I – HHHH, II – HHHM, III – HHMM, IV – HMMM і V –MMMM. Ізоферменти мають нумерацію: I – ЛДГ₁ II – ЛДГ₂, III – ЛДГ₃, IV – ЛДГ₄ і V – ЛДГ₅. Перші два ізофермента (ЛДГ₁ і ЛДГ₂) при електрофорезі рухаються до анода – анодні фракції, останні два (ЛДГ₄ і ЛДГ₅) рухаються до катода – катодні фракції і середній ізофермент (ЛДГ₃) займає проміжне положення.

Фракції відрізняються між собою біологічною роллю. Так, анодні фракції здійснюють процес перетворення піровиноградної кислоти в аеробних умовах, катодні – в анаеробних, а проміжна фракція – в аеробних і анаеробних. Для кожної тканини і органу характерний свій ізоферментний спектр. Так, в міокарді, мозку, нирках і еритроцитах переважають ізоферменти ЛДГ₁ і ЛДГ₂. Саме під їх впливом з молочної кислоти утворюється піровиноградна кислота, яка служить джерелом ацетил-КоА. ЛДГ₄ і ЛДГ₅ типові для скелетної мускулатури, тканин легень і печінки. Під впливом цих ізоферментів піровиноградна кислота відновлюється до молочної кислоти. ЛДГ₃ переважає в тканинах ендокринних залоз і селезінки.

Спектр ізоферментів може змінюватися в різні періоди онтогенезу і при патології. Його визначення дає можливість діагностувати хворобу і контролювати лікування. Так, при нефриті у складі крові і сечі з’являються додаткові фракції ЛДГ₄ і ЛДГ₅, нетипові для здорових тварин. При захворюваннях легень у крові і сечі зростає вміст ЛДГ₃.

Механізм дії ферментів

Механізм ферментативного каталізу є об’єктом дослідження багатьох учених. При ферментативному каталізі виявляється білкова природа ферментів, їх термолабільність, вплив рН середовища, специфічність дії, висока каталітична здатність, чутливість до активаторів і інгібіторів. Ферментативна реакція протікає згідно закону дії мас.

Ферменти і енергія активації. Ферменти – це біологічні каталізатори. Вони впливають на швидкість реакцій в двох напрямах: прискорюють розщеплення або синтез певних речовин. Збільшення швидкості реакції відбувається внаслідок зміни енергії активації молекул субстратів. Енергія активації E характеризує енергетичний бар’єр, який необхідно подолати, щоб привести реагуючі речовини в активний стан. Він обумовлений силами міжмолекулярного зчеплення або міжмолекулярного відштовхування реагуючих речовин. Швидкість реакції можна збільшити, якщо збільшити число молекул, що активуються, або зменшити висоту енергетичного бар’єру. Молекули субстратів можна привести в активний стан різними прийомами. Одним з них є нагрівання, при якому в розчинах зростає швидкість руху молекул і можливість їх зіткнення. За наявності каталізатора знижується енергетичний бар’єр і енергія активації. Так, для розщеплення сахарози на глюкозу і фруктозу під впливом сірчаної кислоти E=134400 Дж/моль, а за участю інвертази – 40420 Дж/моль. Для гідролізу казеїну соляною кислотою E=109200 Дж/моль, пепсином – 50400 Дж/моль. Енергія активації розкладання Н₂О₂ без каталізатора рівна 75600 Дж/моль, з участю колоїдної платини – 49140, каталази печінки – 23100 Дж/моль.

Теорія ферментативного каталізу. Існуючі теорії, пояснюючи взаємодію ферменту і субстрата, допускають тимчасове їх з’єднання з утворенням проміжного фермент-субстратного комплексу. Теорія ферментативного каталізу (теорія Міхаеліса – Ментен) припускає такі етапи:

I етап. Між субстратом і ферментом виникає зв’язок, внаслідок чого утворюється фермент-субстратний комплекс ES, в якому компоненти зв’язані між собою ковалентним, іонним, водневим та іншими зв’язками.

II етап. Субстрат під впливом приєднаного ферменту активується, стаючи доступним для відповідних реакцій каталізу ES.

III етап. Здійснюється каталіз ES*.

IV етап. Вивільнюється молекула ферменту E і продукти реакції P.

Послідовність перетворень відображає схема:

Теорія ферментативного каталізу була підтверджена експериментально. Так, з хріну був виділений фермент, що розщеплює пероксид водню – пероксидаза коричневого кольору. Після з’єднання ферменту Е з субстратом Н₂O₂ (S) виникає фермент-субстратний комплекс ES зеленого кольору. Через деякий час субстрат активується, утворюючи фермент-активований субстрат ES* червонуватого кольору. Він розщеплюється на коричневий фермент E і продукти розпаду P.

Б. Чанс розробив чутливі методи для спектрофотометричного вивчення кінетики ферментативних реакцій на всіх етапах каталізу.

Кінетика ферментативних реакцій. Кожна хімічна реакція протікає з певною швидкістю. Біологічне призначення ферментів полягає в направленому підвищенні швидкості хімічних реакцій.

Ферментативна кінетика – розділ хімічної кінетики, що вивчає залежність швидкостей ферментативних реакцій від хімічної природи реагуючих речовин (субстратів, ферментів) і умов їх взаємодії (концентрації компонентів, рН, складу середовища, температури, дії активаторів або інгібіторів та ін.).

Розрізняють декілька типів ферментативних реакції: необоротні реакції з одним субстратом, оборотні реакції з одним субстратом, необоротні реакції з двома субстратами і т.д. Найбільш поширені необоротні реакції з одним субстратом.

Згідно теорії ферментативного каталізу (Л. Міхаеліс і M. Ментен; Дж. Бріггс і Дж. Холдейн), фермент E спочатку реагує з субстратом S, що призводить до утворення фермент-субстратного комплексу ES (в багатьох реакціях – двох і більше комплексів, що виникають в певній послідовності). Фермент-субстратний комплекс характеризується константою швидкості реакції його утворення k₊₁ і константою швидкості реакції розпаду k_–1:

Для характеристики утворення фермент-субстратного комплексу була прийнята субстратна константа, або константа дисоціації Кs, яка рівна:

Величина субстратної константи залежить від природи субстрату і ферменту. При однакових початкових концентраціях ферменту і субстрату концентрація комплексу [ES] буде тим більша, чим менша величина Кs:

Субстратна константа визначає ступінь спорідненості ферменту і субстрату. Так, для інвертази, яка здійснює гідролітичне розщеплення сахарози до глюкози і фруктози, K_S=0,0167. Тут концентрація фермент-субстратного комплексу перевищує концентрацію вільних ферменту і субстрата приблизно в 60 разів.

У другій фазі ферментативного каталізу фермент-субстратний комплекс розпадається на фермент E і продукт реакції P. Обидві фази ферментативного каталізу з’єднано в систему, типову для необоротних реакцій з одним субстратом:

В системі k₊₂ означає константу швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу на фермент Е і продукт реакції P.

Для повної характеристики ферментативного процесу використовується константа Міхаеліса Кm. Вона виражає відношення констант трьох реакцій, показаних в системі:

Числовий вираз Кm завжди дещо більше, ніж Ks. Так, значення Кs для фермент-субстратного комплексу сахараза – сахароза рівно 0,0167, а величина Кm – 0,0280 моль/л. Кm для різних ферментів неоднакова.

Швидкість хімічної реакції, що каталізується ферментом, вимірюється кількістю молів субстрата, які перетворюються за одиницю часу. Так, швидкість ферментативної реакції, що протікає за оптимальних умов (повне насичення ферменту субстратом, температура 25°С або 37°C, рН), позначається символом V і називається максимальною, або початковою, швидкістю. Вона визначається константою швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу і концентрацією ферменту:

Для ферментативної реакції, яка протікає при недостатньому насиченні ферменту субстратом, характерна спостережувана швидкість . Вона визначається добутком константи швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу з утворенням продукту реакції Р і концентрації фермент-субстратного комплексу [ES]:

Якщо врахувати, що

,

і

,

то

Таким чином, швидкість ферментативної реакції прямо пропорційна константі швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу з утворенням продукту реакції, концентраціям ферменту, субстрату і обернено пропорційна субстратній константі.

Для стаціонарної стадії реакції концентрація [ES] постійна. Якщо [S] > [Е],то

Застосовуючи константу Міхаеліса, можна спростити рівняння:

Спостережувану швидкість реакції можна виразити рівнянням:

При збільшенні концентрації субстрату [S], коли [S] > Km

Тут швидкість ферментативної реакції прагне до максимальної швидкості. Швидкість реакції можна охарактеризувати рівнянням Міхаеліса – Ментен:

З рівняння витікає, що при незначній концентрації субстрату швидкість ферментативної реакції лінійно залежить від [S], а при дуже високій концентрації субстрату вона прагне максимальної швидкості Vmax і вже не змінюється із збільшенням [S]. Рівняння також показує, що при збереженні рівня [S] > [E] швидкість реакції пропорційна концентрації ферменту E.

Номенклатура і класифікація ферментів

У даний час відомо понад 1000 ферментів. У міру розвитку біохімії виникала необхідність у вдосконаленні номенклатури і класифікації ферментів. До перших ферментів, відкритих біохіміками, відносяться ферменти, що здійснюють гідролітичне розщеплення речовин, – гідролази. Потім були відкриті ферменти, що здійснюють негідролітичний розпад складних речовин – десмолази, або ліази та ін. Ферменти почали називати за характером каталітичної дії, природою субстрату та іншим ознакам, додаючи до кореня слова суфікс –аза. Так виникли тривіальні назви ряду класів (наприклад, гідролази), груп (пептидази) і окремих представників (амілаза) ферментів.

На V Міжнародному біохімічному конгресі, що проходив у 1961 р. в Москві, була прийнята нова класифікація і номенклатура ферментів. За основу був узятий принцип класифікації ферментів по типу хімічних реакцій, які вони каталізують. Всі відомі ферменти діляться на шість класів:

1. Оксидоредуктази – ферменти, які каталізують окисно-відновні реакції.

2. Трансферази – ферменти, які каталізують реакції міжмолекулярного перенесення різних хімічних груп і залишків.

3. Гідролази – ферменти, які каталізують реакції приєднання або відщеплення окремих груп або залишків молекул з участю води.

4. Ліази – ферменти, які каталізують реакції відщеплення від субстрата негідролітичним шляхом певних груп з утворенням подвійних зв’язків або реакції приєднання таких же груп по подвійних зв’язках.

5. Ізомерази – ферменти, які каталізують реакції внутрішньомолекулярного переміщення різних атомних груп або зв’язків (ізомерні перетворення речовин).

6. Лігази (синтетази) – ферменти, які каталізують з’єднання двох і більше молекул простих речовин в одну за рахунок макроергічного зв’язку молекули АТФ або іншого донатора енергії.

Кожний клас ферментів підрозділяється на підкласи, які, у свою чергу, діляться на підпідкласи, підпідкласи складаються з окремих представників. Єдина система класифікації ферментів заснована на чотиризначному десятковому коді, згідно якому класам, підкласам, підпідкласам і індивідуальним ферментам привласнюються номери (шифри). Перша цифра шифру показує, до якого з шести класів відноситься даний фермент, друга цифра означає підклас в класі, третя – підпідклас, четверта – порядковий номер ферменту в даному підпідкласі. Ферменти, для яких каталітичні реакції вивчені недостатньо, тимчасово віднесені в підпідклас з номером 99. Наприклад, деякі ферменти класу оксидоредуктаз (цифра 1), для яких не встановлена природа природного акцептора (підклас 1) позначаються 1.1.99 і т.д.

В даний час біохіміки користуються двома номенклатурами – тривіальною (робочою) і систематичною. Тривіальна номенклатура використовується в повсякденній практиці. Тривіальні назви ферментів короткі, наприклад, пепсин, трипсин, уреаза, мальтаза, лактаза.

Систематичні назви точно ідентифікують фермент і по можливості точно визначають його дію. Систематична назва ферменту складається з двох частин: перша частина назви відображає назву головного субстрата, друга – характер реакції, яка каталізується, і суфікс –аза. На початку шифру ставиться дві букви – КФ (класифікація ферментів) і чотири числа; розділених між собою крапками, – чотиризначний десятковий код ферменту. Так, фермент, який гідролітично розщеплює пептидний зв’язок між двома залишками гліцина (гліцилгліцина), називається гліцилгліцин-гідролаза, його шифр – КФ 3.4.3.1. Якщо фермент каталізує реакцію між двома субстратами (зокрема, перенесення окремих груп атомів), то в першій частині назви ферменту вказуються назви цих субстратів, ставиться двокрапка без інтервалу, а в другій частині вказується характер хімічної реакції і додається суфікс –аза. Так, фермент, що переносить атоми водню від молочної кислоти на кофермент НАД, називається L-лактат:НАД-оксидоредуктаза, його шифр – КФ 1.1.1.27. У ряді випадків дається докладна вказівка про окремі сторони хімізму дії ферменту (за допомогою дужок) за систематичною назвою. Так, фермент, який дезамінує L-глутамінову кислоту шляхом перенесення водню на НАД, називається L-глутамат:НАД-оксидоредуктаза (дезамінуюча), його шифр – КФ 1.4.1.2.

За новою класифікацією можна швидко знайти в списку ферментів потрібний фермент, визначити його тривіальну і систематичну назву, номер (шифр), активні групи і кофактори, характер хімічної реакції, яку він каталізує, дізнатися про джерела сировини для його одержання та ін.

Нижче приводяться відомості за новою класифікацією і номенклатурою ферментів 1961 р. з додаванням змін, внесених пізніше Асамблеями Міжнародного біохімічного союзу. Класи представлені повністю, підкласи, підпідкласи і індивідуальні ферменти – вибірково, залежно від їх значення в обміні речовин.