Тема 6. Реакція імунофлуоресценції (ріф) або метод флуоресцуючих антитіл (мфа)
Індикація бактеріальних і вірусних антигенів у інфікованих матеріалах, тканинах тварин та клітинних культурах за допомогою флуоресциюючих антитіл (сироваток) набула значного поширення в діагностичній практиці. Імунофлуоресцентний метод належить до методів експрес-діагностики. За чутливістю і специфічністю він не поступається іншим серологічним реакціям.
Названа реакція запропонована і розроблена Кунсом в 1942 році. Автор реакції з’єднав антитіла імунної сироватки з флуорохромом, внаслідок чого вони почали світитися (флуоресціювати) в люмінісцентному мікроскопі під дією ультрафіолетових променів. Таку сироватку назвали міченою. Кращим флуорохромом вважають флуоресцеїн ізотіоціонат (ФІТЦ). Флуорохром у певній кількості вносять у сироватку, де він адсорбується на молекулах антитіл. Мічену сироватку очищають від неімунних білків і зайвого флуорохрому фільтрацією через сефадекс. При нанесенні на фіксований мікробний препарат міченої сироватки, антитіла адсорбуються на специфічних (гомологічних) мікробних об’єктах (антигенах), міцно з ними зв’язуються і тоді останні світяться в люмінісцентному мікроскопі жовто-зеленим кольором. Якщо антиген (гетерологічний) не відповідає міченим антитілам, що знаходяться у сироватці, то останні легко видаляються при промиванні препарату.
РІФ має переваги перед РА, РП, РЗК. По-перше, дає змогу ідентифікувати мікроби не лише в чистій культурі, а і у змішаній і в мазках-відбитках з патологічного матеріалу, гістозрізах з уражених тканин, а також у препаратах з інфікованих курячих ембріонів. По-друге, за її допомогою можна вивчати морфологію мікробних об’єктів (бактерій, мікоплазм, рикетсій). По-третє, не потребує у діагностиці багато часу, тобто є експрес-методом.
Розрізняють три модифікації реакції імунофоуоресценції: прямий, непрямий двоетапний і непрямий триетапний. Найчастіше застосовують два перші варіанти.
П р я м и й в а р і а н т (рис. 13а). Для ідентифікування збудника інфекції на предметному склі готують мазки - відбитки з виділеної культури або патологічного матеріалу. Препарат з нанесеним матеріалом підсушують на повітрі і фіксують у ацетоні від 5 до 50 хв краще при температурі мінус 20°С. На предметне скло з зафіксованим антигеном наносять люмінісцуючу імунну сироватку, що містить антитіла до антигену, що діагностують. Препарат поміщають у вологу камеру (чашку Петрі) з фільтрувальним папером, змоченим водою і витримують у термостаті при 37–38°С протягом 15–30 хв, або при кімнатній температурі в темному місці 40–50 хв. Потім препарат промивають у проточній воді 5–10 хв від залишку білків, що не зв’язались, рН не нижче 7,0.
Промитий препарат висушують фільтровальним папером, наносять диметилфталат (нелюмінісцуючу імерсійну олію) і розглядають у люмінісцентному мікроскопі. Якщо у препараті є мікроби, специфічні щодо антитіл сироватки, то вони яскраво світяться на темному фоні мікроскопа. Цим методом користуються лише для ідентифікації невідомого антигену. Недоліком його є необхідність приготування люмінісцуючої сироватки для кожного виду ідентифікованого мікроорганізма.
Н е п р я м и й в а р і а н т РІФ (рис. 13б). Порівняно з описаним вище методом цей універсальніший, тому що за допомогою однієї універсальної міченої сироватки можна виявити різні види мікроорганізмів.
Метод двоетапний. На першому етапі на фіксований препарат наносять краплю імунної, не міченої сироватки специфічної до передбачуваного антигену, і ставлять у термостат на 15–20 хв. Потім промивають водою. Антитіла, які відповідають антигену, що є у препараті, не відмиваються.
На другому етапі на препарат наносять краплю антивидової люмінісцуючої сироватки, що містить антитіла проти глобулінів першої сироватки, і знову поміщають у термостат в умовах вологої камери на 15–20 хв. Після цього препарат промивають, висушують і мікроскопують.
Антивидова сироватка – це мічені флюорохромом антитіла проти глобулінів крові тих тварин, від яких одержано імунну сироватку до передбачуваного антигену. Таким чином, антитіла першої (не міченої, специфічної) сироватки є антигеном для мічених антитіл антивидової сироватки. В результаті до комплексу антиген – антитіло, що утворився на першому етапі реакції, приєднуються антитіла антивидової сироватки, тобто утворився подвійний комплекс, який можна виявити за допомогою люмінісцентного мікроскопа (рис. 14).
Антивидові сироватки отримують імунізацією глобулінами тварин тих видів, від яких отримували специфічні сироватки.
Питання для самоконтролю:
Суть реакції імунофлуоресценції.
Методика постановки прямого методу РІФ та врахування результатів реакції.
Суть та методика постановки непрямого (двоступеневого) методу РІФ.