Получение аминокислот

По значению для м/организма аминокислоты подразделяют на заменимые и незаменимые. К незаменимым относят те аминокислоты, которые не синтезируются в человеческом и животном организме. Для человека- 8 аминокислот: изолейцин, лейцин, лизин, метиония, треонин, триптофан, валин, фенилаланин. М/организмы сами синтезируют аминокислоты из аммиака и нитратов. Потребность в аминокислотах велика. В мире производится 500 тыс.тонн в год аминокислот. Широко используются в пищевой промышленности как питательные добавки. В больших количествах аминокислоты применяют как добавку к растительным кормам. Также применяют в медицине-4%, косметике. По объему .и по значимости первое место занимает- метионин.

Технология получения аминокислот базируется на принципах ферментации продуцентов и выделении вторичных метаболитов. Размножают маточную культуру вначале на агаризованной среде в пробирках, затем на жидкой среде в колбах, посевных аппаратах, затем в головных ферментаторах.

Если аминокислота предусмотрена в качестве добавки к кормам, то биотехнологический процесс кормового продукта включает следующие стадии:

• ферментацию

• стабилизацию

Известны 2 способа получения аминокислоты:

• одноступенчатый

• двухступенчатый

По первому слособу-продуцент аминокислоты культивирует на оптимальной для биосинтеза среде. Целевой продукт накапливается в культуральной жидкости, из которой его выделяют.

В двухступенчатом способе микроб-продуцент культивирует в среде, где он получает и синтезирует все необходимые вещества для последующего синтеза целевого продукта.

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОБНЫХ ИММУНОБИОЛОГИ­ЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

К микробным иммунобиологическим препаратам относят вакцины, им­мунные сыворотки и диагностикумы.

Вакцины по праву занимают ведущее место в лечении и профилактике инфекционных заболеваний. Термин "вакцина" происходит от латинского слова vacca -корова. Вначале под вакциной понимали содержимое оспен­ных пузырьков, получаемое от коров для предохранительных прививок человеку. В настоящее время в понятие вакцины входит все, что получают из патогенных микробов и что вызывает образование специфических ан­тител при введении в организм. Вакцины получают как из самих патоген­ных микроорганизмов, так и используя продукты их жизнедеятельности. Применение вакцин обеспечивает невосприимчивость к заражению соот­ветствующим возбудителем и стимулирует защитные силы организма.

Вакцина - это препарат ослабленного или убитого инфекционного аген­та (бактерии, вируса и т.п.) или его отдельных компонентов, несущих ан­тигенные свойства и способных вызывать образование активного иммуни­тета к данной инфекции.

В настоящее время вакцины можно разделить на четыре основные груп­пы:

1. вакцины из клеток микроорганизмов:

• живые;

• убитые;

2. химические вакцины, представляющие собой различные, извлекаемые химическим путем, компоненты микробной клетки:

• полисахаридные;

• рибосомальные;

3. анатоксины - вакцины, получаемые из продуктов обмена клеток;

4. вирусные вакцины:

• живые;

• инактивированные.

Вакцины могут быть в виде монопрепаратов, предназначенных для профилактики специфических инфекций, а также в ассоциированной фор­ме для создания иммунитета против нескольких инфекций. В зависимости от числа входящих в вакцину микробных видов их называют ди-. три- и т.д. или поливакцинами.

Вакцины из клеток патогенных микробов

Вакцины из инактивированных клеток патогенов - представляют собой взвесь клеток болезнетворных бактерий или грибов, обладающих выра­женной иммуногенностью, но лишенные патогенности. Их получают инактивируя микробную взвесь нагреванием, добавлением формалина, спирта, ацетона, облучая ее ультрафиолетовым светом или разрушая ульт- развуком. В качестве одного из примеров приготовления убитой вакцины может быть приведена технология производства сухой спиртовой брюшнотифозной вакцины. Для ее изготовления применяют штаммы бактерий, возбудителей брюшного тифа. Одним из таких штаммов является штамм Salmonella typhi.

Технологический процесс, состоит из следующих стадий. I) Подбор вакцинных штаммов. Для приготовления убитой вакцины отбирают несколько наиболее вирулентных и полноценных в антигенном отношении штаммов. Вирулентность - степень болезнетворного действия микроба. Ее можно рассматривать как способность микроба адаптироваться к организму хозяина, т.е. к новой среде, и преодолевать его защитные механизмы. 2) Получение маточной культуры (посевного материала). Посевным материалом служит 18-часовая агаровая культура в изотоническом растворе хлорида натрия (0,8%NaCl) с числом клеток 5-10 ⁴ кл/мл, вводимая в объеме 5-10% к объему засеваемой среды, или 5-6-часовая бульонная культура. 3) Приготовление и стерилизация питательной среды. Брюшнотифозные бактерии выращивают на белково-гидролизатных или нолуеинтетических средах, позволяющих получать достаточно высокий выход биомассы, например бульон гидролизата казеина. 4) Выращивание микробной взвеси - ферментация. Выращивание проводят в асептических условиях методом глубинного культивирования в ферментерах. Режим культивирования периодический. В процессе культивирования подается стерильный воздух. Дополнительное перемешивание эарируемой среды обеспечивается турбинной или роторной мешалкой. Параметры культивирования: t=37°C, pH 7,6-7,8. Выращивание проводят 10-12 ч до концентрации бактерий порядка 4-6 -10¹⁰ кл/мл. 5) Инактивация микробной взвеси. Для проведения инактивации полученную взвесь микробных клеток двукратно обрабатывают 96%-м этиловым спиртом в соотношении 1:4 и 1:10 соответственно. Обработку проводят при тщательном перемешивании в специальных емкостях. 6) Отделение клеток от кулътуралъной жидкости, как правило, проводят центрифугированием. 7) Титрование вакцины (стандартизация). Инактивированную биомассу ресуспенди-руют в зотоническом растворе хлорида натрия. Готовая вакцина должна содержать эпределенное количество микробных тел в 1 мл. Титр убитой брюшнотифозной вакцины составляет 5 • 10⁹ кл/мл. К готовой вакцине прибавляют консервант, например, фенол (0,25%). 8) Контроль производится трем основным критериям: а) стерильность (отсутствие живых клеток генного микроба); б) безвредность (определение переносимости и токсичности); в) эффективность (способность препарата формировать антибактериальный иммунитет). 9) Розлив в ампулы; 10) Лиофилизация. пензюо в ампулах замораживают при t= - 40 - 50°С и лиофильно высущ_ивают (в режиме возгонки воды). 11) Запайка ампул под вакуумом.

Убитыми являются вакцины против брюшного тифа, бруцеллеза (лечебная), гонореи, дизентерии, коклюша, холеры, лептоспироза и др.

7. Вакцины из живых клеток - содержат живые микробы, вирулентность которых ослаблена при сохранении их иммуногенных свойств.

Живые вакцины не должны содержать консервантов или каких-либо других ингибиторов роста и развития вакцинных штаммов. Сухие вакцины имеют вид белой или желтоватой плотной массы, хорошо растворимой в воде. Перед употреблением сухую вакцину растворяют в необходимом объеме стерильного изотонического раствора хлорида натрия или в стерильной дистиллированной воде с соблюдением всех правил асептики Если живые вакцины выпускают в жидком виде, то допускается ис­пользование стабилизаторов: сахарозы, хлорида магния или забуференно-го изотонического раствора хлорида натрия. Жидкие вакцины представ­ляют собой мутные жидкости, легко суспендирующиеся при встряхива­нии, в которых при хранении образуется осадок.

В настоящее время применяют вакцины из живых ослабленных микро­организмов для профилактики туберкулеза (вакцина БЦЖ), бруцеллеза, туляремии, чумы, гриппа, оспы, полиомиелита и др. Живые вакцины вво­дят обычно однократно.

Вакцины из клеточных компонентов патогенных микробов

Вакцины полисахаридные. Полисахариды, содержащие различные саха­ра или аминосахара, не связанные с липидами или белками при достаточ­ной величине молекулярной массы могут выступать в роли полноценных антигенов.

Рибосомальные вакцины. У прокариот рибосомы содержат примерно 60% РНК и 40% белка, у эукариот - 55% и 45% соответственно. В стационарной фазе бактериальная клетка содержит 10⁴ рибосом; это число возрастает в период экспоненциальной фазы роста. Впервые рибосомальный препарат из штамма Mycobacterium tuberculosis был приготовлен в 1965 году. Рибосомы в чистом виде не применяют в качестве вакцин, но используют обогащенные ими полисахаридные и другие антигенные препараты.

Анатоксины

Анатоксины - препараты, полученные из обезвреженных экзотоксинов микробов и обладающие антигенными и иммуногенными свойствами. В настоящее время широко применяются анатоксины, полученные из дифтерийного, столбнячного, ботулинического, стафилококкового экзотоксинов, а также из токсинов, возбудителей газовой гангрены, яда некоторых змей и растений. Как правило, анатоксины выпускаются сорбированными на геле гидрооксида алюминия. При использовании анатоксинов вырабатывается активный иммунитет.

Иммунные сыворотки и гамма-глобулин

Специфические иммунные сыворотки содержат антитела к определенным видам микроорганизмов. Сывороточные препараты используют в следующих целях:

для лечения, так как введение в организм антител обеспечивает

быстрое обезвреживание микробов и их токсинов;

для профилактики, чтобы быстро создать невосприимчивость у человека, контактировавшего с больным или инфицированным материалом;

микроорганиз­ма выделенного от больного, что позволяет установить вид (тип) мик-

Введение сыворотки в организм человека создает пассивный иммунитет.

Различают сыворотки антитоксические, которые получают путем иммуни­зации животных анатоксинами или токсинами микробов, и антимикробные. домученные при многократной иммунизации животных бактериями и эндо­токсинами. Наиболее эффективны антитоксические сыворотки, которые бы­стро обезвреживают экзотоксины в организме больного. Их применяют для лечения дифтерии, скарлатины, столбняка, ботулизма, газовой гангрены и заболеваний, вызванных стафилококками. Антимикробные сыворотки менее эффективны, поэтому их используют реже.

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВДСТВА БИОГАЗА

Обострение экологических проблем, истощение запасов невозобнов­ляемых энергоресурсов, рост цен на них, обусловили глобальный интерес к разработке и использованию технологии биоконверсии органических отходов для получения тепловой и других видов энергии.

Известно, что животные плохо усваивают энергию растительных кор­мов и более половины ее уходит в навоз, который прежде всего является ценнейшим видом органических удобрений. Вместе с тем, он может быть использован в качестве возобновляемого источника энергии. Концентра­ция животных на крупных фермах и комплексах обусловила увеличение объемов навоза и навозных стоков, которые должны утилизироваться, не загрязняя окружающую среду.

Одним из путей рациональной утилизации навоза и навозных стоков является их анаэробное сбраживание, которое обеспечивает обезврежи­вание навоза и сохранение его как важнейшего органического удобрения при одновременном получении биогаза.

Очистные сооружения, использующие анаэробное брожение для об­работки органических отходов, известны с конца прошлого столетия. Первый такой опыт относится к 1895 г., когда в английском городе Экзе-тер был введен в эксплуатацию так называемый септиктенк для очистки коммунальных отходов. Помимо чисто санитарных задач, эта установка обеспечивала получение биогаза, который использовался для освещения улиц.

Анаэробный метод обработки отходов долгое время применялся для стабилизации осадков водоочистных станций и отходов животноводства. Однако с началом энергетического кризиса 1970-х годов этот метод при­влек особое внимание в связи с идеей получения биогаза в основном из навоза сельскохозяйственных животных.

Анаэробное сбраживание навоза с получением биогаза осуществляет­ся в специальных биогазовых установках, основными элементами кото­рых являются герметические емкости (рис. 8.1).

Технологический процесс обработки навоза осуществляется следую­щим образом. Из животноводческого копительную емкость 2, далее фекальным насосом 3 его загружают в ме­тантенк 4 (емкость для анаэробного сбраживания навоза). Биогаз, обра­зующийся в процессе брожения, поступает в газгольдер 5 и далее к потре­бителю. Для нагрева навоза до температуры брожения и поддержания теплового режима в метантенке установлен теплообменник б, через кото­рый протекает горячая вода, нагреваемая в котле 7. Сброженный навоз выгружают в навозохранилище 8.

В метантенке обеспечиваются все необходимые параметры процесса (температура, концентрация органических веществ, кислотность и др.). Метантенк имеет тепловую изоляцию, позволяющую обеспечивать и поддерживать на заданном уровне температурные режимы сбраживания, в нем также имеется устройство для постоянного перемешивания навоза. Поступление навоза в метантенк регулируется так, чтобы процесс сбра­живания протекал равномерно.

Во время сбраживания в навозе развивается микрофлора, которая по­следовательно разрушает органические вещества до кислот, а последние под действием синтрофных и метанообразующих бактерий превращают­ся в газообразные продукты — метан и углекислоту. Степень разложения органического вещества при анаэробном сбраживании навоза составляет 25—45 %.

• Деградация органических веществ при метаногенезе осуществляется как многоступенчатый процесс, в котором углеродные связи постепенно разрушаются под действием различных групп микроорганизмов. Соглас­но современным воззрениям, анаэробное превращение практически лю­бого сложного органического вещества в биогаз проходит через четыре последовательных стадии гидролиз сложных биополимерных молекул (белков, липидов, по­ лисахаридов и др.) на более простые мономеры: аминокислоты, углево­ ды, жирные кислоты и др.;

• ферментация (брожение) образовавшихся мономеров до еще бо­ лее простых веществ — низших кислот и спиртов, при этом образуются также углекислота и водород;

• ацетогенная стадия, на которой образуются непосредственные предшественники метана: ацетат, водород, углекислота;

• метаногенная стадия, которая ведет к конечному продукту расще­ пления сложных органических веществ — метану.

Первичные анаэробы разлагают органические вещества до предшественников мета­на: водорода и углекислоты, ацетата, метанола, метиламидов, формиата. Ввиду субстратной специфичности метаногенов их развитие без трофи­ческой связи с бактериями предыдущих стадий невозможно. В свою оче­редь, метановые бактерии, используя вещества, продуцируемые первич­ными анаэробами, определяют возможность и скорость реакций, осуще­ствляемых этими бактериями. Центральным метаболитом, осуществляю­щим регуляторную функцию в метанообразующем сообществе, является водород. За счет поддержания низкого парциального давления водорода в системе становится возможным его межвидовой перенос, меняющий метаболизм первичных анаэробов в сторону образования непосредствен­ных предшественников метана. Если водород из системы не удаляется, то образуются более восстановленные продукты — летучие жирные кисло ты и спирты. Метаболизм этих соединений осуществляется синтрофны-ми бактериями, для жизнедеятельности которых необходимо связывание образующегося водорода метановыми бактериями.

Физические свойства биогаза позволяют судить о воз­можностях его использования. Объемная теплота сгорания, температура воспламенения и предел воспламеняемости определяются в основном со­держанием СН₄, поскольку незначительное количество Н₂ и H₂S на этот показатель почти не оказывает влияния, зоо

Биогаз успешно применяется как топливо. Его можно сжигать в го­релках отопительных установок, водогрейных котлов, газовых плит, ис­пользовать в холодильных установках абсорбционного типа, в инфра­красных излучателях, в автотракторных двигателях, в газовом цикле Отто (с искровым зажиганием) и газодизельном цикле (с впрыскиванием небольшой дозы запального дизельного топлива). Карбюраторные двига­тели легко переводятся на газ: достаточно заменить карбюратор на смеси­тель.

При производстве электроэнергии из биогаза в электрический ток преобразуется всего 30 % его энергоресурса, остальная часть — отброс­ная теплота. Ее можно использовать при нагревании воды для бытовых нужд и содержания скота, отопления жилых помещений и теплиц, подог­рева воздуха для сушилок, а также при регулировании микроклимата в животноводческих помещениях и нагрева навоза до нужной температуры брожения в биогазовых реакторах.

Кроме того, метановое сбраживание навоза обеспечивает его дезодо­рацию, дегельминтизацию, уничтожение способности семян сорных рас­тений к всхожести, перевод удобрительных веществ в легкоусвояемую растениями минеральную форму. При анаэробной обработке навоза фосфор и калий практически пол­ностью сохраняются в сброженной массе. Потери азота, которые при дру­гих методах обработки навоза составляют до 30 %, в процессе метаноге-неза не превышают 5 %. При этом значительная часть азота, присутст­вующего в свежем навозе в форме органических соединений, в сброжен­ном— содержится в аммиачной форме, которая быстро усваивается растениями.

Экономическими критериями невозможно оценить тот факт, что ана­эробная переработка навоза животных находится в полном согласии со все более строгими требованиями к соблюдению принципов охраны ок­ружающей среды. Навоз после анаэробной обработки является дезодори­рованным, биологически стабилизрованным, не привлекает насекомых.

После анаэробной обработки в навозе значительно уменьшается со­держание пахнущих веществ При анаэробной обработке наличие поливирусов снижается на 98,5 %, индекс Э. коли — от 10⁸ до 10⁵—10⁴ и зародышей паразитов на 90—100%.

Экологические требования к природоиспользованию приобретают особое значение в условиях хозрасчета, когда требуется возмещение ис­пользованных природных ресурсов законодательными актами. При высо­ких ценах на энергию перспективной становится малоэнергоемкая анаэ­робная биологическая очистка с положительным выходом энергии в виде

Получение микробных препаратов-стимуляторов и регуляторов роста

Микроорганизмы, фиксирующие азот из воздуха, подразделяют на свободноживущие в природных условиях и на симбиотические с растениями и другими микробами.

К свободноживущим относят азотобактерии, актиномицеты, к микробным симбионатам-азотоспириллы, симбиоты бобовых растений.

Микробы-азотофиксаторы ежегодно фиксируют примерно 18 10⁷ т молекулярного азота из воздуха, из которых 15% приходится на цианобактерии.

К микробным стимулятороам и регуляторам роста - гиббериллины, фузикокцин, ауксины.

К удобрителям почв можно отнести ризотрофин. Представляет собой торфяную основу, смешанную с ризобактериями. Технологический процесс включает подготовку клубеньковых бактерий и получение инокулята. Инокулят готовят в условиях умеренной аэрации на средах содержащие растительные экстраты и дополнительно вводят неорганические соли фосфаты и карбонаты. Накапливают 5 млрд. клеток в 1 мл. Такую суспензию вносят в “ кислый” торф при 10-15 С. Торф до “обсеменения” бактериями должен быть гомогенным, подсушенным, увлажненным. В подготовленный торф вносят 50 мл суспензии бактерий, перемешивают во вращающем барабане и сохраняют до полугода при 5-10С.

Как регуляторы роста применяется в промышленности. Гиббериллиновая кислота синтезируется микромицетом, относится к группе растительных гормонов сложного химического строения. Образование и накопление гиббериллинов - процесс занимает до 15 суток.

Питательные среды для выращивания содержат 6% глюкозы, глицерина, 0,7% соли аммония, 0,3% неорганический фосфат, микроэлементы. Выход гиббериллинов - 200 мг/л культуральной жидкости.

Фузикокцин-относят к регуляторам роста растений гормонального типа. Он индуцирует корнеобразование у многих древесных и плодовоягодных культур, стимулирует прорастание семян, моркови. Фузикокцин образуется грибом. Продукт получают при глубинной ферментации в периодическом режиме на средах с глюкозой или сахаразой и соевой мукой. Затем экстрагируют хлороформом из культуральной жидкости, сорбируют активированным углем, кристализируют.