Лекция 3. Метод ультратонких срезов

Метод ультратонких срезов – самый распространенный и самый информативный метод для изучения ультраструктуры биологических объектов. Именно с помощью этого метода получены все основные знания о строении клетки. Метод применяется очень широко, для изучения самых разнообразных объектов – от микроорганизмов до тканей и органов любых животных, растений и грибов. Используется также для изучения неорганических объектов, которые могут быть обработаны соответствующим образом и порезаны.

Как и для световой микроскопии, используются фиксированные образцы, причем для электронной микроскопии необходимо строгое соблюдение требований к фиксатору – величины рН, осмолярности, температуры фиксации, размера кусочков. После основной фиксации в альдегидном фиксаторе образцы промывают и дофиксируют в 1% р-ре четырехокиси осмия. После этого образцы обезвоживают в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и завершают обезвоживание в ацетоне или пропиленоксиде. Затем – пропитка в смеси ацетона и заливочной среды, используют разные соотношения - 1:1, 1:3 и т.п. После пропитки в смеси кусочки переносят в свежую заливочную среду с катализатором для пропитки и полимеризации. В результате обработки получается твердый блок, с которого и готовят ультратонкие (50-70 нм) срезы. Для приготовления ультратонких срезов на поверхности блока делается пирамидка.

При работе с образцами органов важно точно знать, на какое место заточена пирамидка, поэтому предварительно с поверхности всего образца делают полутонкие срезы, которые изучают в световом микроскопе и выбирают место для заточки пирамидки (прицельная заточка пирамидки).

Ультратонкие срезы собирают на сеточки, затем контрастируют растворами уранилацетата и цитрата свинца, после чего просматривают в электронном микроскопе и фотографируют.

Иммуноэлектронная микроскопия

Задача - выявление антигенов на субклеточном уровне с помощью меченых электронно-плотными частицами антител (коллоидное золото, ферритин). Трудоемкий и дорогостоящий метод, требующий специальной быстрой фиксации и процедуры обезвоживания и заключения в заливочную среду, которые обычно проводят при пониженной температуре. Заливочные среды – разные, но все – специальные, полимеризация идет не при высокой температуре. Водорастворимые заливочные среды. Все процедуры проводки и заливки направлены на сохранение структуры антигенов. После приготовления ультратонких срезов проводят реакцию с антителами.

Первичные антитела используются разные, не все коммерческие антитела годятся для ИЭМ, не все антитела, «работающие» в ИФА, «работают» в ИЭМ. Вторичные антитела конъюгированы с частицами золота или ферритина, именно они обеспечивают визуализацию антигенов. Для каждого конкретного случая требуется подбор разведений первичных и вторичных антител.

Недостатки метода иммуноэлектронной микроскопии:

- малая толщина срезов лимитирует интенсивность метки;

- слабый контраст – снижение качества изображения, затрудняет идентификацию структур.