Лекция 2.
Подготовка материала для светооптического исследования
В световом микроскопе можно исследовать самые разнообразные образцы. Очень важно выбрать метод исследования, адекватный поставленной задаче. Нужно различать задачи: «увидеть что-то» и «изучить строение чего-то». В первом случае стоит использовать наиболее простые и доступные методы. Во втором – методы, обеспечивающие наиболее полную информацию об объекте.
Использование фиксированных объектов дает широкие возможности для разработки огромного числа методов окрашивания клеток и тканей, выявляющих различные компоненты клеток. Следует внимательно подходить к выбору фиксатора, и делать этот выбор с учетом последующих исследований материала, поскольку некоторые методы окраски разработаны для определенного вида фиксации. Фиксатор должен быстро проникать в ткани, опережая процесс аутолиза. Скорость проникновения (фиксации) зависит от многих параметров, для формалина она составляет около 1 см в сутки. Более плотные ткани фиксируются дольше. Очевидно, что чем меньше кусочек, тем лучше сохранность структур.
Процедура фиксации направлена на предотвращение распада тканей и клеток, на сохранение их прижизненной структуры. В процессе фиксации происходит инактивация клеточных ферментов, предупреждается диффузия растворимых белков, сохраняется структура ткани. Фиксация предотвращает рост бактерий и грибов в ткани. Существует множество разных фиксаторов, многие из которых направлены на фиксацию отдельных компонентов клеток и тканей, иногда – в ущерб остальным структурам.
Фиксаторы-смеси на основе уксусной кислоты. Существует много вариантов фиксаторов, включающих уксусную кислоту. Наиболее простые –
5% р-р уксусной к-ты в абсолютном спирте (фиксация по Уолмену и Бехару).
Фиксатор Карнуа – 10 мл абс.спирта + 3 мл хлороформа + 1 мл уксусной к-ты.
Более сложные фиксаторы могут включать в себя сулему, бихромат калия, метиловый спирт, пикриновую кислоту и ряд других добавок.
Сложный состав фиксирующих растворов отражает историю поиска оптимального фиксатора. Существует большое количество фиксирующих растворов, но общим для всех является механизм сшивки молекул образца непредельными связями молекул фиксатора. Практика показала, что наиболее адекватной, т.е. сохраняющей структуру, является фиксация альдегидными фиксаторами. В ее основе лежит сшивка биологических молекул альдегидными группами фиксатора, когда двойные связи стабилизируют химическую структуру клеток, соединяясь с их компонентами.
Наибольшее распространение получили альдегидные фиксаторы на основе формальдегида (формалина) и глутарового альдегида, причем первый используется несравнимо шире, поскольку его растворы более стабильны, а сам он существенно дешевле и доступнее.
Формалиновая фиксация.
Формалин взаимодействует главным образом с основными (щелочными) аминокислотами, образуя метиленовые мостики, сшивающие молекулы. Важное значение для адекватной фиксации имеют два параметра: величина рН и осмолярность раствора. На практике соблюдение этих параметров зависит от задач и методов исследования.
Самый простой вариант фиксатора – 10% раствор промышленного формалина на водопроводной воде. Промышленный формалин представляет собой 40% насыщенный раствор формальдегида, именно в такой форме он получается в результате промышленного производства. Такой раствор для удобства считают 100%-ым. Т.е., рабочий фиксирующий раствор соответствует 4% раствору формальдегида. Величина рН такого фиксатора около 8 единиц, а осмолярность очень низка. Очевидно, что такая фиксация не обеспечивает адекватной сохранности цитологических структур. Однако, она широко используется, в первую очередь – для патоморфологических исследований в медицине. Таким же раствором заливается анатомический материал. Преимущество такой фиксации – быстрота и простота приготовления фиксатора, его дешевизна.
Параформальдегид (параформ) - удобный источник для получения формальдегида. Представляет собой смесь продуктов полимеризации формальдегида (полиоксиметиленов) общей формулы [—CH2O—] n (n = 8—100); кристаллическое вещество белого цвета. Фиксатор из параформа готовят, нагревая его взвесь в соответствующем растворителе (буферном растворе).
Нейтральный формалин готовят следующим образом:
К 1 л имеющегося в продаже 40%-ного раствора формалина добавляют 100 г молотого мела или углекислой магнезии. Полученный раствор несколько раз в течение дня перемешивают, а затем отстаивают, после чего с помощью 0,1 Н HCl или 0,1 Н NaOH доводят значение pH раствора формалина до 7,0.
Степень усложнения формалинового фиксатора начинается с доведения рН водного раствора до физиологических значений 7,2-7,4. Затем следует большое число вариантов фиксатора, когда используют буферные растворы и соблюдают осмолярность.
В нашей практике мы используем универсальный фиксатор, который готовится из параформальдегида на солевых растворах, используемых при культивировании клеток. Очевидно, что эти растворы по своему составу наиболее адекватны внутренней среде живых клеток. Для работы готовится 4% раствор параформальдегида. Величину рН нужно контролировать, поскольку разные партии параформа могут ее изменять.
Условия фиксации должны обеспечить наименьшую скорость разложения ткани в глубине образца, поэтому фиксацию образцов рекомендуется проводить при +4С. Величина кусочков зависит от задач исследования, для электронной микроскопии берут небольшие образцы.
Глутаровый альдегид
Глутаровый альдегид – диальдегид, реагирует с аминогруппами, сульфгидрильными группами и, возможно, с ароматическими циклическими структурами. «Сшивает» молекулы сильнее, чем формальдегид, поэтому менее предпочтителен для иммуногистохимии. Фиксаторы на основе ГА медленнее проникают в ткани, чем формалин, поэтому могут возникнуть артефакты на основе диффузии растворимых белков и нарушения структуры.
В современных микроскопических исследованиях используют разнообразные фиксаторы, в зависимости от задач исследования.
«Проводка» образцов для микроскопического исследования
Процесс подготовки материала для микроскопического исследования, помимо фиксации, обычно включает в себя обезвоживание материала, пропитку его заливочной средой и заливку. Задача – сделать материал пригодным для изготовления достаточно тонких срезов для окрашивания и просмотра в микроскопе. В качестве заливочной среды для световой микроскопии преимущественно используется парафин, иногда – целлоидин и желатин. В последнее время появились синтетические заливочные среды, успешно заменяющие парафин, часто изготовленные на его основе. Абсолютное большинство методов специфического окрашивания разработано для парафиновых срезов.
Итак, после фиксации мы имеем образец, пропитанный водным раствором фиксатора. Для заливки в парафин, который не смешивается с водой, нужно избавиться от воды и пропитать образец парафином. Для этого проводят обезвоживание образца в растворах этилового спирта возрастающей концентрации (от 30% до абсолютного), затем выдерживают в смеси абсолютного спирта с ксилолом или в изопропиловом (бутиловом) спирте, затем –в ксилоле, смеси ксилола с парафином и, наконец, в парафине. Пропитка парафином проводится при температуре 56С. Разогретый образец помещают в формочку и заливают разогретым парафином. После затвердевания образец монтируют на подставку и блок готов для резки. Нужно иметь в виду, что для гистологических целей подходит не каждый парафин, существуют свои особенности его подготовки. От качества парафина во многом зависит качество срезов.
Для проводки материала используют плотно закрывающуюся посуду, чтобы не было испарения растворов. При ручной проводке образцы перекладывают из раствора в раствор, и проводка занимает, в зависимости от величины образцов, от суток до недели. В лабораториях обычно используют автоматы разной модификации, в которых происходит вращение сосудов, которое обеспечивает перемешивание жидкости. Время проводки сокращается до суток. Существуют ускоренные схемы проводки.
Готовые парафиновые блоки могут храниться неограниченное время. Парафиновые срезы готовят на микротомах с помощью стального или (реже) стеклянного ножа Толщина срезов зависит от свойств самого парафинового блока, ткани и от модели микротома и квалификации работника. Последняя имеет достаточно большое значение. В самом лучшем случае толщина парафинового среза составляет около 3 мкм, что позволяет видеть один слой клеток в срезе. На практике обычно готовят срезы толщиной 5-8 мкм. Срезы помещают на предметное стекло, которое может быть покрыто адгезивом, обычно – яичным белком. Это нужно, что бы срезы не отваливались при окраске.
Парафиновые срезы на стекле могут храниться годами, но обычно их окрашивают через день-два после изготовления. Перед окраской проводится обратная проводке процедура – депарафинирование. Это нужно для того, чтобы клетки снова оказались водопроницаемыми, а их структуры стали доступными для красителей. Депарафинирование проводят в обратном порядке: сначала растворяют парафин в ксилоле, затем срезы помещают последовательно в растворы этилового спирта понижающейся концентрации до 30%, затем – в дистиллированную воду. Срезы готовы к окрашиванию.
Окрашивание производят вручную, помещая стекло в растворы разных химикатов, или нанося красящие растворы на стекло пипеткой. Существуют автоматы для окрашивания срезов, но их эксплуатация может быть очень дорогой, поскольку нужно заливать большие объемы красителей, которые обычно дороги. Окрашивание парафиновых срезов позволяет выявить самые разнообразные компоненты и структуры клетки. Существует множество разнообразных красителей, обладающих способностью окрашивать клеточные и тканевые структуры. Значительный прорыв в окрашивании гистологических срезов был сделан при внедрении в практику анилиновых красителей.
Наиболее распространенным методом обзорного окрашивания гистологических препаратов, когда видны все типы клеток, является окрашивание гематоксилином и эозином.
Помимо парафиновой заливки, используют заливку в целлоидин и полиэтиленгликоль, при этом применяется другая схема проводки. В желатин заливают кусочки без обезвоживания, сразу после фиксации.
Гистохимия.
Методы гистохимии направлены на выявление тех или иных молекул в клетках и тканях, что позволяет изучать специализированные типы клеток, их изменения в норме и патологии. Существует множество гистохимических методов, многие – очень сложные, многоступенчатые и трудоемкие.
Пример: