Лекция 9.

Наличие ядра – принципиальное отличие эукариот от прокариот. Ядро окружено оболочкой, которая отделяет содержимое ядра от цитоплазмы, создавая отдельный компартмент. Процессы трансляции и транскрипции пространственно разделены,

благодаря наличию ядра, а транспорт молекул в ядро и обратно осуществляется через специальные структуры – ядерные поры.

Ядерная оболочка образована двумя мембранами, внутренней и внешней, между которыми находится перинуклеарное пространство. Мембраны ядерной оболочки различаются по белковому составу. Наружная мембрана, на которой находятся рибосомы, является частью ЭПР. Внутренняя мембрана взаимодействует с белками ядерной пластинки. Мембраны соединены поровыми комплексами.

Ядерная пластинка представляет собой сеточку, сформированную фибриллярным материалом и поддерживающую структуру ядра. Белки, формирующие пластинку, называются ламинами, и относятся к классу промежуточных филаментов. Пластинка служит также местом прикрепления хроматина. Если клетку обработать антителами к ламину, то ядро после деления не формируется, - ламины жизненно необходимы.

Ядерный матрикс. После разрушения ДНК в ядре выявляется сеточка-скелет. Это и есть ядерный матрикс. Одни считают, что он поддерживает структуру ядра. Другие вообще сомневаются, что он есть в живой клетке.

Поровые комплексы ядра

Поровые комплексы ядра – единственные структуры, обеспечивающие транспортные потоки между ядром и цитоплазмой. Это – крупные структуры, диаметром около 120 нм, и массой около 125 миллионов дальтон - в 30 раз больше, чем рибосомы. Строение порового комплекса полностью не изучено. Он сформирован из 100 или более разных белков (нуклеопоринов).

Поровые комплексы играют важную роль в жизнедеятельности клетки, поскольку они «заведуют» транспортом между ядром и цитоплазмой. Белковый транспорт направлен в основном из цитоплазмы в ядро, тогда как РНК транспортируются в цитоплазму. Оба вида транспорта энергетически зависимы и активны. Пассивен лишь транспорт мелких молекул.

В электронном микроскопе ядерные поры имеют вид структур с 8-лучевой симметрией относительно центрального канала. Изучение препаратов в ЭМ с последующей компьютерной обработкой дало приведенную на слайде модель строения ядерной поры. Это – действительно комплекс: 8 спицеобразных структур образуют ансамбль вокруг центрального канала. Эти структуры связаны с цитоплазматическим и ядерным кольцами. Цитоплазматическое кольцо связано с цитоплазматическими промежуточными филаментами, а ядерное – со структурой, имеющей форму корзинки и расположенной в нуклеоплазме. Центральный канал обычно закрыт своеобразной пробкой, природа которой непонятна. Некоторые считают, что это – часть поры. Другие – что это просто переносимые в данный момент молекулы. На основании данных о связи вольтов с ядерными порами также предполагают, что центральная пора закрыта вольтом.

Диаметр центрального канала около 40 нм, - этого хватает для транспорта крупных молекулярных комплексов.

Между «спицами» находятся мелкие канальцы, диаметром около 10 нм. Очевидно, они предназначены для переноса мелких молекул, которые поступают в ядро путем диффузии, есть также активный АТФ-зависимый транспорт.

Кольчатые пластинки – своеобразные цитоплазматические «поры» - следствие нарушений сборки ядерных пор. Ядерная оболочка – производное ЭПР, поэтому возможно формирование этих структур.

Ядрышко

Ядрышко – наиболее заметная структура в ядре. В ядрышке локализованы синтез рРНК и сборка рибосом. Ядрышко формируется участками ряда хромосом, которые называют «ядрышковый организатор». В этом месте ряд хромосом объединяются и транскрибируют рибосомальную РНК, - зоны в хромосомах, где локализованы гены рРНК. У человека в формировании ядрышкового организатора цчаствует около 400 генов.

Участки ЯО имеют вид круглых светлых образований, окруженных электронно-плотными филаментами, которые являются новообразующимися нитями РНК (фибриллярная зона ядрышка).

Т.е., фибриллярная зона – место локализации и транскрипции генов рРНК, здесь практически нет белков рибосом.

Плотная фибриллярная зона – место процессинга и начала сборки рибосом. Белки присоединяются к РНК и формируют рибонуклеопротеин, затем – субъединицы рибосом, - гранулярная зона ядрышка.

Гранулярная зона – место накопления рибосом, готовых к импорту в цитоплазму. Малая и большая субъединицы транспортируются по отдельности, через поровые комплексы.

Размеры ядрышка зависят от метаболической активности клетки.

Структурная организация наследственного материала Хромосомы и хроматин

Эукариоты и прокариоты имеют геномы разной сложности и организации. У прокариот геном замкнутый, циркулярный и организован в виде одной хромосомы. Геном эукариот линейный сегментированный и упакован в хромосомы, количество которых варьирует. Длина ДНК человека составляет около 2 м, а упакована она в ядро размером 5-10 мкм. Почему имеется разная упаковка ДНК у про- и эукариот – непонятно.

Хроматин – комплекс ДНК и белков.

Хроматин назван так из-за способности интенсивно окрашиваться. Если разрушить ядро и удалить белки, то можно визуализировать нити ДНК толщиной 4 нм.

В хроматине обычно белков в два раза больше, чем ДНК. Основную часть белков хроматина составляют гистоны. Гистоны – мелкие белки, содержащие большое количество основных АК аргинина и лизина, которые усиливают связывание белков с кислой ДНК. Существует 5 классов гистонов, которые очень схожи у разных видов эукариот. Масса гистонов примерно такая же, как масса ДНК, они относятся к т.н. «обильным» белкам.

Хроматин содержит также негистоновые белки, общая масса которых примерно равна массе гистонов. Негистоновых белков около 1000 разновидностей, и они принимают участие в самых разнообразных процессах, в том числе, связанных с репликацией ДНК и экспрессией генов.

Основная структурная единица хроматина – нуклеосома, выявленная при изучении деградации ДНК нуклеазой микрококка, когда было показано, что ДНК нарезается на фрагменты длиной около 200 пар оснований. Внутри этих фрагментов ДНК устойчива к действию нуклеазы. ЭМ показала, что ДНК имеет вид бус, с размером единиц около 200 пар оснований. Эти единицы и были названы нуклеосомами. Нуклеосомы являются динамичными структурами, они собираются-разбираются в зависимости от вовлечения участка ДНК в репликацию.

Следующий этап исследований выявил наличие кора в нуклеосомах, который и соответствовал «бусинке» в ЭМ. Анализ этих частиц показал, что кор (Бусинка) образован плотно упакованными парами гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, вокруг которых обернут фрагмент ДНК длиной 146 пар оснований, который делает 1,75 оборота. Молекула гистона Н1 скрепляет ДНК на входе и выходе. Таким образом формируется хроматосома, которая состоит из 166 пар оснований, скрепленных линкерным гистоном Н1. Коровые гистоны высококонсервативны у всех эукариот. Линкерный гистон может отсутствовать (дрожжи), что говорит о том, что он не является обязательным для формирования хроматосомы.

Упакованная в хроматосомы ДНК образует нить толщиной около 10 нм. Эта упаковка приводит к уменьшению длины ДНК примерно в 6 раз. Нить толщиной 10 нм сворачивается в спираль толщиной 30 нм. В этой упаковке важную роль играет гистон Н1. У дрожжей его нет, и хроматин у них упакован в более длинную структуру.

Степень конденсации хроматина зависит от стадии жизненного цикла клетки. В интерфазе хроматин находится в деконденсированном состоянии и в основном представлен нитями 30 нм - эухроматин. Около 10% эухроматина обычно находится в состоянии 10-нм нитей – активная транскрипция.

В интерфазе около 10% хроматина высококонденсировано – гетерохроматин.

Две разновидности гетерохроматина – конститутивный, или структурный - никогда не транскрибируется (центромеры); и факультативный – не транскрибируется в момент исследования.

Участки транскрипции – наименее спирализованные.

В митозе хроматин находится в конденсированном состоянии, транскрипция останавливается. 30-нм нити сворачиваются и формируют хромосомы. В ЭМ в хромосомах видны петли. Полагают, что нити уложены вокруг белкового каркаса. Механизм конденсации ДНК и структура митотических хромосом полностью не поняты до сих пор.

Идентификация ДНК, как генетического материала. Структура ДНК.

Представления о строении ДНК, сформулированные в 1953 г. Уотсоном и Криком, являются основой современной молекулярной биологии. В те времена было известно, что

ДНК – полимер двух пуриновых (аденин и гуанин) и двух пиримидиновых оснований (цитозин и тимин). Понимание пространственной структуры ДНК стало возможным благодаря данным о наличии водородных связей, определяющих образование альфа-спирали, и данным рентгеноструктурного анализа о том, что ДНК - спираль. Уотсон и Крик сформулировали представление о том, что ДНК – двойная спираль, несущая на внешней стороне остатки сахаров и фосфата.

Спаривание пуриновых и пиримидиновых оснований высокоспецифично. А-Т, Г-Ц. Комплементарность цепей ДНК.

Каждая цепь несет информацию, достаточную для определения последовательность оснований второй цепи.

Вообще, история двойной спирали ДНК – яркая иллюстрация того, как может складываться история науки. Все основные данные, которые использовали Уотсон и Крик, были уже известны и опубликованы, однако только в специальной литературе, или в особо детальных учебниках приводятся имена людей, которые показали, что ДНК – спираль, что соотношение между основаниями 1:1. Между тем, считается, что «Уотсон и Крик – основоположники, - они открыли двойную спираль ДНК». На самом деле они осмыслили известные данные и сформулировали выводы-представления.