Тема 8. Хроматографічний метод аналізу

1. Загальні поняття, фізичні основи методу.

Хроматографічний метод аналізу призначений для визначення якісного і кількісного складу сумішей газоподібних і рідких речовин. Метод заснований на розподілі піддослідної суміші на компоненти за рахунок різної сорбованості компонентів при переміщенні суміші вздовж шару сорбенту. При цьому компоненти суміші під дією потоку рухомої фази переміщуються вздовж шару сорбенту (нерухома фаза) з різними швидкостями. Рухома фаза являє собою газ або рідину, нерухома фаза — рідину або тверде тіло.

Нерухома фаза в хроматографах розміщена в хроматографічних колонках і являє собою тверду порошкоподібну речовину або рідину, нанесену у виді тонкої плівки на твердий носій. В залежності від агрегатного стану рухомої фази (газ чи рідина) хроматографи розділяють відповідно на газові і рідинні. Сфера застосування газових і рідинних хроматографів різна, але принцип дії однаковий.

Схема хроматографічного аналізу двохкомпонентної суміші (рис.1) ілюструє принцип дії і взаємозв'язок основних елементів хроматографа. Доза піддослідної суміші А + В чітко визначеного об’єму вводиться дозатором 1 у потік рухомої фази С і попадає в хроматографічну колонку 2 (рис.1,(І)). У колонці, внаслідок взаємодії з нерухомою фазою D, компоненти суміші А і В сповільнюють рух і набувають різних швидкостей. Розходження швидкостей руху компонентів у колонці призводить до утворення зон бінарних сумішей (компонент + рухома фаза), розділених зоною чистої рухомої фази (рис.1,(ІІ)).

Рис. 1. Схема хроматографічного аналізу

При подальшому переміщенні компонентів вздовж колонки зона чистої рухомої фази між ними збільшується доти, доки компоненти не вийдуть з потоком рухомої фази із колонки (рис. 1,(ІІІ, IV)). Після виходу з колонки компоненти у встановленій послідовності надходять у детектор 3 — пристрій, що перетворює зміну складу рухомої фази у вихідний електричний сигнал. Цей сигнал реєструється вторинним приладом 4 у вигляді графіка, який називають хроматограмою.

Хроматографічне розділення засноване на сорбції — поглинанні газів, парів чи розчинених речовин (сорбатів) твердими або рідкими сорбентами. В залежності від природи сорбційних процесів їх поділяють на абсорбцію, адсорбцію і хемосорбцію (коли адсорбція супроводжується утворенням на поверхні адсорбенту хімічних з'єднань). Адсорбція, абсорбція і хемосорбція можуть відбуватися в хроматографічних пристроях одночасно, але домінує, як правило, один з цих процесів. У випадку, коли переважну роль відіграє адсорбція, метод розділення називають адсорбційною хроматографією, якщо ж розділення обумовлене абсорбційним процесом, то метод називають розподільною хроматографією.

Різновидами адсорбційної хроматографії, що застосовується в газових і рідинних хроматографах є, відповідно, газо-адсорбційний і рідинно-адсорбційний методи.

В обох випадках нерухома фаза являє собою тверду порошкоподібну речовину.

У розподільній хроматографії поділ на компоненти відбувається за рахунок розподілу поділюваних речовин між плівкою рідкої нерухомої фази і рухомою фазою, при чому поділ суміші на компоненти обумовлений розходженням швидкостей розчинення компонентів у рідкій нерухомій фазі. У газових хроматографах застосовують два варіанти розподільної хроматографії: газо-рідинний і капілярний. У першому випадку рідка нерухома фаза нанесена у вигляді плівки на поверхню порошкоподібного твердого носія, який поміщають у хроматографічні колонки, названі насадочними, у другому — рідка фаза нанесена на внутрішню поверхню капіляра, що названий капілярною хроматографічною колонкою.

Відповідно до теорії Ленгмюра кількість речовини а, що поглинається одиницею маси адсорбенту у зрівноваженому стані:

а = mbC/(1+bC), (1)

де m і b — сталі, що залежать від властивостей адсорбенту і адсорбованої речовини (сорбата);

С — концентрація розчину.

Якщо С << 1, то а = mbC (рівняння прямої, що виходить з початку координат). Цей випадок відповідає рівнянню Генрі: а = ГС, де Г— коефіцієнт Генрі.

Якщо С >> 1, то а = mbC/bC — рівняння прямої, паралельної осі абсцис.

При адсорбції суміші із n компонентів рівняння (1) для і-го компонента має вид:

(2)

Графічна залежність а=f(C) при постійній температурі названа ізотермою адсорбції і є основною характеристикою адсорбційної здатності сорбенту. Залежність кількості адсорбованої речовини від температури при постійному тиску виражається рівнянням ізобари адсорбції:

a = k*exp(Q/RT)/ , (3)

де k — константа;

Q — теплота адсорбції;

R — універсальна газова стала;

Т —абсолютна температура.

Фазова рівновага між розчином газу в рідині і газовою сумішшю над рідиною в процесі абсорбції газу при температурі нижче критичної системи рідина — насичена пара характеризується законом Рауля:

p_п = p_н*C_м, (4)

де р_п — парціальний тиск компонента в парах над рідиною;

р_н — тиск насиченої пари чистого компонента при даній температурі;

С_м — мольна частка даного компонента в розчині.

На процес хроматографічного розподілу істотно впливають дифузійні процеси, що протікають одночасно з рухом компонента вздовж колонки. Дифузія значною мірою визначає характер розподілу маси компонента в потоці рухомої фази. Якщо прийняти, що коефіцієнт дифузії не залежить від концентрації, то можна визначити розподіл концентрацій компонента вздовж колонки в будь-який момент часу на основі другого закону Фіка:

дС/дτ=Dд²С/дх² (5)

де τ— час;

х—поздовжня координата;

D—коефіцієнт дифузії;

С— концентрація компонента.

Розв’язок цього рівняння за умови, що початковий об’єм компонента в суміші досить малий, приводить до рівняння кривої Гауса:

С=С_тах*ехр(-х²/4Dτ₀) (6)

де С_тах = q/ — максимальна концентрація компонента в потоці рухомої фази (q — маса компонента);

τ₀ — час перебування компонента в хроматографічній колонці;

С — концентрація компонента в потоці рухомої фази на відстані х від координати, що відповідає С_тах .

У реальних процесах хроматографічного розподілу при лінійній ізотермі сорбції і незначному об’ємі піддослідної суміші розподіл концентрацій компонентів у потоці рухомої фази також близький до розподілу по кривій Гауса.

На рис. 2 приведений графік хроматографічного піка на виході з колонки в процесі вимивання компонента. У хроматографі хроматографічний пік перетворюється детектором в електричний сигнал і реєструється. Якщо детектор і реєструючий прилад не спотворюють форму хроматографічного піка, то графік відрізняється від зображеного на рис.2 лише одиницями вимірювання і масштабом.

Площу піка, пропорційну масі речовини q, визначають з використанням інтегруючих вимірювальних приладів, і ЕОМ або розраховують шляхом апроксимації площі піка через площу трикутника: S ≈ h*μ

а) б)

Рис. 2. Графік зміни концентрації вимірюваного компонента в рухомій фазі на виході із колонки(а), та хроматограма двохкомпонентної суміші (б).

Градуювальна характеристика хроматографа в залежності від того, який параметр прийнятий як вихідний сигнал (h чи S), виражається рівняннями:

h=k_h q; S=k_s q, (7)

де k_h — чутливість хроматографа; k_s — величина, пропорційна чутливості.

Для оцінки граничних аналітичних можливостей хроматографів за чутливістю і порівняння хроматографів різних типів використовують характеристику, названу межею виявлення С_min;

С_min =2Δq/(h_П*μ), (8)

де Δ - рівень флуктуаційних шумів нульового сигналу хроматографа (нульовий сигнал — сигнал хроматографа при відсутності в рухомій фазі піддослідних компонентів);

h_П - амплітуда максимуму хроматографічного піка, приведена до шкали, на якій виміряна величина Δ.

При постійних умовах хроматографічного поділу (температура в колонці, швидкість рухомої фази, геометричні параметри колонки, властивості і кількість нерухомої фази) кожен компонент піданалізної суміші проходить через колонку протягом строго визначеного часу, що є якісною характеристикою, яка дозволяє розпізнавати компоненти піданалізної суміші. Час від моменту введення дози в хроматограф і до моменту одержання максимуму хроматографічного піка називається часом утримання τ_R. У колонці він складається з двох складових: часу τ₀ перебування речовини в рухомій фазі і часу τ_Ŕ, протягом якого речовина знаходиться в сорбенті; τ_R= τ₀+τ_Ŕ.

Час утримання залежить від швидкості рухомої фази, тому на практиці використовують поняття об’єму утримування.

(9)

де V₀ — об’єм пустот в колонці

Q — об'ємна витрата рухомої фази.

Сукупність хроматографічних піків, зареєстрованих в процесі поділу дози піддослідної суміші, утворює хроматограму (див. рис. 2); нульова лінія , відповідає нульовому сигналу хроматографа.

Число піків на хроматограмі може досягати декількох сотень, ступінь поділу піків не завжди достатня, нульова лінія в процесі аналізу може зміщатися («дрейфувати»), піки можуть бути асиметричними, тобто відрізнятися від кривої Гаусса, значним може бути рівень флуктуаційних шумів. Зазначені обставини істотно ускладнюють обробку хроматограм і одержання надійних кількісних результатів. Проте в більшості практичних випадків сучасні хроматографи забезпечують необхідну якість аналізу, часто більш високу, ніж при використанні інших аналітичних методів.

Сучасні хроматографи забезпечують можливість аналізу складних сумішей, що містять сотні компонентів. Мінімальні кількості піданалізних компонентів можуть складати величини до 10^-14 гр. Унікальні аналітичні можливості хроматографів засновані на тому, що в процесі аналізу піддослідна суміш розділяється на компоненти і лише після цього надходить в аналізатор складу.

Особливістю хроматографічного методу є можливість поділу речовин з однаковими температурами кипіння, що неможливо, наприклад, при застосуванні методу дистиляції. Високоефективна рідинна хроматографія при аналізі багатьох речовин, особливо малолетючих і нетермостабільних, конкурує з газовою хроматографією у відношенні ефективності поділу, а також швидкості і зручності проведення аналізів. Рідинні хроматографи дозволяють проаналізувати численні суміші, аналіз яких неможливий газовими хроматографами. Це в першу чергу відноситься до біологічних і фізіологічних об'єктів, що руйнуються при високій температурі, яка необхідна для аналізу газовим хроматографом

Рідинні хроматографи застосовують у медицині, а також для якісного і кількісного аналізу: нуклеїнових кислот, наркотичних і лікарських препаратів, пестицидів і гербіцидів, полімерів, амінокислот, жирів, вуглеводів, поверхнево-активних речовин, антиоксидантів.

Рідинні хроматографи поступаються газовим у відношенні чутливості детекторів, але володіють більш ефективними і різноманітними методами поділу сумішей.

Крім аналітичних хроматографів існують так називані препаративні хроматографи, призначені для розділення сумішей з метою одержання чистих фракцій. Їх широко використовують у виробництві особливо чистих речовин і в тому числі лікарських препаратів.