Глава 2 материалы и методы исследования

2.1 Организация экспериментов с лабораторными животными

Для проведения экспериментов были отобраны крысы со средней двигательной активностью, которые были разделены на контрольную и экспериментальную группы, каждая из которых состояла из 10 крыс.

Экспериментальной группе крыс (n=10) в течение семи дней вводили внутрибрюшинно физиологический раствор объемом 0,2-0,25 мл, содержащий HgSO4 (20 мг/кг), вызывая накопление ртути в тканях организма, а контрольной (n=10) – чистый физиологический раствор в эквивалентном объеме. На восьмой день поведение крыс обоих групп тестировали на тревожность (тесты «открытое поле» (ОП), «чёрно-белая камера» (ЧБК), «крестообразный приподнятый лабиринт» (КПЛ)), а также в модельных опытах на депрессию (тест Порсолта и «подвешивание за хвост») в порядке возрастания силы стрессового воздействия.

При проведении экспериментов придерживались «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

В большинстве работ, посвященных действию на животных факторов различной природы и интенсивности статистическая оценка результатов, дается для «среднего животного». Такой подход позволяет выявить основные тенденции, но нивелирует индивидуальные различия. Однако хорошо известно, что всегда можно обнаружить особей устойчивых и сенситивных к действию различных факторов. При этом усредненные результаты демонстрируют отсутствие достоверного эффекта. Данные многочисленных исследований свидетельствуют о том, что реакция человека и животных на действие различных факторов может быть не одинакова. При этом устойчивость животных с различными индивидуально-типологическими особенностями к действию различных факторов обуславливается факторами генетической и индивидуальной детерминации. Установлена индивидуальная чувствительность человека и животных к экстремальным факторам среды, в частности, к эмоциональному, болевому, гипокинетическому и другим видам стресса.

Для выявления изменений участия дофаминэргической системы в проявлении психофизиологических функций в норме и при интоксикации ионами свинца использовался стандартный набор тестов.

2.2 Поведенческие модели стресса

Тестирование проводилось в утреннее время.

Тест открытое поле. Влияние соединений на спонтанную и исследовательскую активность и эмоциональность животных изучали с помощью теста открытого поля. Поле представляло собой прямоугольник 90·110 см, с деревянными стенками и пластиковым полом с начерченными на нем 21 квадратом, в центре которых располагались фишки, а в 8 крайних, граничащих со стенками квадратах были проделаны специальные отверстия. Тестирование проводилось при освещенности 90 лк.

Крыс тестировали в течение 2 минут через 1,5 часа после инъекций. Исследовали следующие поведенческие феномены:

• горизонтальная двигательная активность (ГДА) определялась по числу пересеченных квадратов, причем засчитывалось пересечение квадрата в случае переход его границ обоими задними лапами, являлась характеристикой локомоторной активности животных.

• вертикальная двигательная активность (ВДА) – по числу вертикальных стоек, рассматривалась как проявление исследовательской активности,

• исследовательская активность (ИА) – по числу заглядываний в отверстия и обнюхивания фишек, также являлась проявлением исследовательского поведения,

• груминг (Гр) – по числу умываний передними лапками головы, трактовался как показатель эмоционального состояния животного,

• дефекация (деф) – по числу болюсов, также как и Гр, являлась показателем эмоциональности животного, а также показателем состояния вегетативной нервной системы,

• уринации (Ур) – по числу уринаций.

Тест черно-белая камера. Камера представляет собой ящик из оргстекла, состоящий из двух равных отсеков (так называемые «светлый» и «темный» отсеки камеры) 252525 см. В перегородке между отсеками имеется выдвижная дверка. «Темный отсек» сверху снабжен открывающейся наверх крышкой, снаружи, поверх оргстекла по периметру стен и пола, был полностью обклеен черной светонепроницаемой бумагой. Над «светлым отсеком» имелась электрическая лампа мощностью 40 Вт.

Во время эксперимента в течение первых 5 мин крыса находилась в «темном отсеке». Затем, над «светлым отсеком» зажигалась электрическая лампочка и открывалась дверца в перегородке. Тестирование длилось 5 мин, в ходе которых визуально регистрировалась ИА животных: число и длительность (с) выглядываний из «темного отсека» в «светлый» через отверстие в перегородке, а также число и длительность (с) выходов в «светлый отсек». Под выглядыванием понималось пересечение всей мордочкой животного порога в перегородке между отсеками, а под выходом – пересечение мордочкой и всеми передними лапами порога. При этом регистрировалась длительность каждого двигательного акта в отдельности, и сумма в целом. Показателем неспецифического поведения служила интенсивность Деф (об этом свидетельствовало число болюсов, обнаруженных в темном отсеке после окончания тестирования).

Тест «крестообразный приподнятый лабиринт» изготовлен из непрозрачного материала. Ширина рукавов – 14 см при длине 50 см, высота стенок в закрытых рукавах составляла 30 см. В месте пересечения рукавов располагалась центральная открытая площадка 14 х 14 см, на которую и помещается крыса в начале проведения теста. КПЛ располагался на высоте 55 см над уровнем пола на центральной опоре-ножке. Продолжительность теста составляла 5 мин, в течение которых визуально регистрировали поведенческие характеристики крысы:

• число и время выходов в открытые рукава лабиринта;

• число и время выходов в закрытые рукава лабиринта;

• число стоек (вертикальная исследовательская активность);

• количество заглядываний вниз из открытых рукавов (оценка риска);

• число переходов через центральную платформу лабиринта;

• груминг и число дефекаций.

Под выходом в рукав лабиринта подразумевают любое продвижение по рукаву лабиринта, если при этом мордочка и все передние лапы животного пересекают условную линию между центральной платформой и рукавом. Стойкой считается приподнимание животного на задних лапах в закрытом рукаве лабиринта над уровнем его стенок. Заглядывание вниз («оценка риска») регистрируется, если в закрытом рукаве лабиринта животное пересекает всей мордочкой или какой-либо ее частью горизонтальную границу между краем рукава и его условным продолжением. После тестирования каждого животного лабиринт протирается изнутри мокрыми и сухими салфетками.

Тест Порсолта. При тестировании крысы опускались в металлический цилиндр высотой 60 см и диаметром 50 см, уровень воды составлял 35-40 см, температура (24±2) °С. Длительность теста составляла 3 мин, в течение которых регистрировались следующие поведенческие показатели: латентность первого «зависания» (иммобильность >5 с), суммарное время активного и пассивного плавания (с) и количество движений, направленных на освобождение от воды: груминогоподобные движения, отряхивания, выпрыгивания, ныряния. Под иммобильностью подразумевается полное отсутствие плавательных движений при пассивном удержании животного на воде.

После тестирования каждого животного в «открытом поле» и «черно-белой камере», дно камер вначале тщательно протирали влажной тряпкой (без применения каких либо дезинфицирующих и дезодорирующих средств) и затем сухой. Это исключало возможность внесения корректив в поведение следующего испытуемого.

В тесте «подвешивания за хвост» исследуется антидепрессантный профиль химических веществ. Тест основан на том, что крысу держат за хвост в висячем положении туловища до того момента, пока она не коснется мордой основания хвоста. Время этого события (иммобильность) и является показателем депрессии.