§ 7. Спектрометр комбинационного рассеяния

Комбинационное рассеяние (КР) света — хорошо известное физи­ческое явление, широко используемое в исследовании структуры молекулы, ее динамического поведения, внутримолекулярных коле­баний и взаимодействия с окружением. Наибольшее применение этот метод нашел в физике и химии, тогда как его использование в биологии сдерживалось главным образом сложностью исследуемых соединений. Лишь в последнее время удалось преодолеть методи­ческие трудности, и в настоящее время спектроскопию КР успеш­но используют в изучении структурно-функциональных свойств фотосинтетического пигментного аппарата, возбудимости нервных волокон, зрительных пигментов, гемоглобина и др.

КР-спектрометр должен удовлетворять следующим требова­ниям.

1. Возбуждать спектры КР биообъектов несколькими монохро­матическими линиями, попадающими в полосы поглощения пиг-

в тексте

ментов фотосинтетического аппарата, что позволяет снимать их спектры резонансного КР.

2. Иметь оптимальную оптическую схему возбуждения био­объекта, приготовленного по специальной методике для снятия спектров КР.

3. При снятии спектров КР сильно рассеивающих биологических образцов обеспечить высокий уровень дискриминации рэлеевского рассеяния при малых сдвигах от частоты возбуждения.

4. Автоматически регистрировать, накапливать, запоминать, обрабатывать и воспроизводить спектры КР.

В качестве базового спектрального прибора был выбран оте­чественный спектрограф ДФС-24, источником возбуждающего све­та служили серийные отечественные непрерывные газоразрядные лазеры, система регистрации была создана на основе многоканаль­ного анализатора импульсов NTA-1024 производства ВНР.

Схема спектрометра приведена на рис. 47.

Источником возбуждающего света служат промышленные непрерыв­ные лазеры, генерирующие излучение с к= 441,6; 488; 514.5 и 633 нм. В большинстве случаев интенсивность света, генерируемая лазером, велика, поэтому излучение лазеров ослабляли светофильтрами (Ф) и ирисовыми диаф­рагмами (ИД). Кроме того, диафрагмы вместе с монохроматором служат для подавления непрерывного фонового излучения газового разряда трубки ла­зера н постоянного фонового освещения.

Рис. 47. Схема спектрометра комбинационного рассеяния:

Д — диафрагма, ИФ — интерференционный светофильтр, МДР-23 — монохроматор, О образец. ПЗ — полупрозрачное зеркало, Ф — светофильтр; остальные объяснения см.

л п

л ф

№

Описываемая здесь установка используется для снятия как спектров КР, так и поляризационных спектров люминесценции. В такого рода измере­ниях необходимо менять поляризацию возбуждающего света. Для этого слу­жат пластинки (П): пластинка К/2 для поворота плоскости поляризации на 90° или пластинка Х/4 для превращения линейно поляризованного света в по­ляризованный по кругу. Отводная пластинка (ОП) и фотодиод (ФД) служат для измерения и контроля стабильности мощности возбуждающего излуче­ния, объектив (Л) образует осветитель образца (О).

Рассеянное образцом излучение собирается системой линз (Л) на вход­ную щель спектрографа ДФС-24. Поляризационную призму (П) (призму Глана) используют как анализатор при поляризационных измерениях, Мо- нохроматор обладает различным пропусканием для света с разной поляриза­цией, поэтому при снятии спектров КР для исключения влияния этого эф­фекта перед входной щелью монохроматора устанавливают деполяризующий клин (ДК). Светофильтр служит для устранения света, который может нало- житься на исследуемый спектр во втором порядке дифракции.

Регистрация спектров КР в описываемом спектрометре осуществляется фотоэлектронным умножителем ФЭУ-79, работающим в режиме счета фотонов.

Отношение регистрируемого сигнала к шуму тем больше, чем больше время измерения, и пропорционально |/7. Время измерения можно увеличить, уменьшая скорость сканирования и увеличивая постоянную времени усилителя. Однако такой подход связан с воз­растанием экспозиции образца, что может привести к его фотодест­рукции. Другим подходом к увеличению времени измерения яв­ляется суммирование спектров КР от нескольких образцов одного и того же вещества. Такую возможность дает многоканальный анализатор импульсов NTA-1024.

При возбуждении окрашенных образцов интенсивность линий резонансного КР зависит от концентрации вещества и геометрии ос­вещения, определяющей потери на перепоглощение. Очевидно, схе­му освещения необходимо создавать таким образом, чтобы поглоще­ние возбуждающего и рассеянного света было минимальным при оптимальной величине снгнала КР. Следует учитывать также, что при работе с фотоактивными соединениями надо использовать как можно более низкие интенсивности возбуждения, исключающие теп­ловое и фотохимическое разрушение препарата. В этих условиях выбору оптимальной оптической схемы возбуждения придается большое значение.

Расчеты показывают, что для мощностей рассеянного излуче­ния Р,, в схемах с углом между направлениями возбуждения и регистрации 90 и 180° получаются следующие выражения:

Р, = Л 1—1 ■ (Ш.7.1)

Ь к (v₀) е (v) с

/>₂₌₌ dfe (1 —е—£ef^v») +siv)]ei>^ (III.7.2)

е (v₀) + e (v)

где P„ — мощность возбуждающего света; b, с. I — геометрические размеры рассеивающего объема; е (v₀) и е (v)—экстинкции в образ­це на частоте возбуждающего света v„ и регистрации v; А —- коэф­фициент пропорциональности, характеризующий тензор КР.

Для слабоокрашенных или прозрачных образцов гсЬ С 1, поэтому формулы (III.7.1) и (III.7.2) существенно упрощаются и для мощностей рассеянного излучения можно получить

Р₁ = АР₀ cl\ Р₂ = АР₀ cb.

Так как обычно I Ь, то Р\ ^ Р2- Следовательно, при исследо­вании слабоокрашенных или прозрачных образцов оптимальной является схема освещения под углом 90°.

В другом предельном' случае интенсивно окрашенных образ­цов для мощности рассеянного излучения получаются выражения

Р₁ = АР₀/[г (v₀) е (V) cb]- />,« APJ[b (v₀) + е (v)],

из которых следует, что Р₁ < Р₂.

Таким образом, из проведенного анализа видно, что схему с уг­лом 90° между возбуждением и регистрацией целесообразно исполь­зовать для снятия нерезонансного КР. Для схемы с углом 180^е сигнал КР растет с увеличением концентрации резонансно рассе­ивающих молекул при малых концентрациях и почти не зависит от нее для значений [е (v₀) -f е (v)l cb > 3. Эта схема наиболее оп­тимальна для снятия спектров резонансного КР. Плотность мощ­ности возбуждающего света, используемая для снятия КР-спектров в схеме с. углом 180°, меньше, чем в схеме с углом 90°. Основные па­раметры лазерного спектрометра КР: 1. X возбуждающего излуче­ния — 441,6; 488; 514,5; 633 нм. 2. Полуширина аппаратной функ­ции монохроматора на длине волны 500 нм <С 1 см^-1. 3. Обратная линейная дисперсия монохроматора — 0,45 нм/мм. 4. Коэффициент подавления остаточного рассеянного излучения при возбуждении излучением >.= 441,6 нм и отстройке 40 см~' от возбуждаю­щей линии и ширине щелей, соответствующих разрешению 4,4; 6, 6 и 8, 8 см"¹, составляет соответственно 10^7,7; 10⁷ и Ю^в,й. 5. Ско­рости сканирования спектра — 0,012; 0,04; 0,35 и 1,1 нм/мм. 6. Спектры хлорофилла и его производных (коэффициент экстинк- ции Ю⁵ л-моль-'-см'^-1) записываются при концентрации пигментов Ю~⁴ и выше. 7. Регистрация сигналов КР осуществляется в диапа­зоне изменения скорости счета фотонов от 60 до 5- 10^е имп/мин.

Использование автоматизированной системы регистрации спект­ров КР позволяет существенно упростить их обработку и получить значительно больше информации по сравнению с регистрацией в сис­теме ФЭУ — усилитель — самописец. В качестве демонстрации воз­можностей разработанной системы регистрации на рис. 48, А приве­дены спектры одного и того же образца с разным числом накопле­ний. При числе накоплений N = 16 существенно улучшается от­ношение сигнал/шум (в VN ~ 4 раза), что позволяет увеличить интенсивность регистрируемого спектра.

Биологические объекты представляют собой многокомпонентные системы, содержащие большое число люминесцирующих пигмен­тов. Поэтому при многократной записи спектров происходит накоп­ление люминесцентного фона, полностью маскирующего спектр КР. Разработанная система регистрации позволяет осуществить вычитание фона люминесценции и, таким образом, реализовать запись спектров КР люминесцирующих объектов. Из сопоставления

Б

-О

А-), см''

Рис. 48. Спектры комбинационного рассеяния (КР), полученные при различ­ных условиях записи. А — спектр КР одного и того же образца при разном числе накоплений; Б — однократный спектр КР образца без вычитания фона люминесценции (1) и 12-кратнын спектр КР без фона люминесценции (2) (.•центров (рис. 4.8. Б) видно, что описанная система регистрации дей­ствительно позволяет исследовать спектры КР окрашенных и лю- чинесцирующих образцов.

Использование многоканального анализатора в системе регист­рации спектрометра позволяет осуществлять целый ряд операций, облегчающих снятие и интерпретацию спектров. Особенно важно отметить возможность нормирования различных спектров и их срав­нения (вычитания) и сочетания анализатора с ЭВМ, что позволяет автоматизировать процедуру обсчета спектров.

В свою очередь, ЭВМ снабжена необходимым набором программ для анализа как спектра в целом, так и его отдельных линий. В част­ности, отдельная широкая полоса может быть разложена на ком­поненты, что важно для извлечения отдельных линий из уширен­ной полосы, являющейся суперпозицией вклада элементарных ко­лебаний атомов или групп атомов молекул — компонентов иссле­дуемого соединения.

2