Работа № 15. Моделирование биологических окислительно-восстановительных систем

15.1. Сопоставление редокс-потенциалов рибофлавина и метиленового синего

В живых организмах наиболее важными донорами электронов служат атомы водорода органических молекул. При помощи переносчиков электронов, имеющих промежуточный потенциал, осуществляется сложная последовательность реакций тканевого дыхания. Склонность к участию в окислительно-восстановительных реакциях может быть определена путем потенциометрических из­мерений, сводящихся к определению электродвижущей силы цепи, которая составлена из химически инертного электрода, погруженного в исследуемую редокс-систему, и электрода сравнения.

Стандартные окислительно-восстановительные потенциалы, изме­ренные при рН 7, обозначаются Е_о. Окислительно-восстановительный потенциал является величиной, пропорциональной изменению свобод­ной энергии. Вещество с большим окислительно-восстановительным потенциалом (с учетом алгебраического знака) окисляет вещество с меньшим окислительно-восстановительным потенциалом. Т.е. редокс-потенциалы являются мерой способности молекул обмениваться электронами.

Помимо потенциометрического измерения часто используют коло­риметрический метод, наблюдая изменение окраски специальных редокс-индикаторов в испытуемом растворе. Обычно в восстановленном состоянии эти индикаторы бесцветны, а в окисленном обладают опре­деленной окраской. Причем для каждого индикатора зона перехода связана с характерной для него величиной E₀.

Реактивы и материалы: рибофлавин, 0,025% суспензия, метиленовый синий, 0,01% раствор, соляная кислота, концентрированная, цинк, гранулированный.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. В пробирку наливают 5-6 капель воды, 1 каплю взвеси ри­бофлавина и добавляют по каплям раствор метиленового синего до появления синего или зеленовато-синего окрашивания смеси.

2. Бросают в окрашенную смесь кусочек цинка и капают 1 кап­лю концентрированной соляной кислоты. Выделяющийся водород начинает снижать редокс-потенциал системы, происходит восста­новление метиленового синего и рибофлавина. Восстановление первого из них происходит быстрее, поэтому цвет смеси становит­ся сначала зеленым, затем зеленовато-желтым и наконец бледно-желтым или розоватым.

3. Слабо окрашенную жидкость сливают в другую пробирку и наблюдают за изменением цвета. Водород более не образуется, а остаток его уходит в воздух. Восстановленная форма рибофлавина через метиленовый синий передает электроны и ионы водорода на кислород воздуха и раствор желтеет. После этого происходит окис­ление лейкометиленового синего, и содержимое пробирки меняет цвет через зеленый в синий.

Записать результаты опыта и составить схему переноса водорода (электронов и ионов водорода) с учетом стандартных окислитель­но-восстановительных потенциалов использованных компонентов.

15.2. Обнаружение дегидрогеназ лимоннокислого цикла

Непосредственному дегидрированию в организме под влиянием дегидрогеназ подвергаются многие субстраты. Наиболее важными среди них являются изолимонная, α-кетоглутаровая, янтарная (сукцинат), яблочная кислоты, участвующие в цитратном цикле (цикле трикарбоновых кислот или цикле Кребса). Отщепленный от суб­стратов водород (протоны и электроны) передается при помощи ком­плекса ферментов тканевого дыхания в конечном итоге на кислород.

Изолимонная кислота окисляется при дегидрировании и декарбоксилировании в α-кетоглутаровую кислоту, а янтарная — в фумаровую.

При исследовании каталитического действия дегидрогеназы изолимонной кислоты (изоцитратдегидрогеназы) в качестве субстрата используют лимонную кислоту, которая изомеризуется в изолимонную под влиянием фермента аконитатгидратазы (КФ 4.2.1.3), со­держащейся в тканевой кашице наряду с другими ферментами цикла трикарбоновых кислот.

Реактивы и материалы: мышечная кашица, цитрат натрия, 3% раствор (нейтрализованный по лакмусу), сукцинат натрия, 3% раствор (нейтрализованный по лакмусу), сульфосалициловая кислота, 20% раствор, метиленовая синь, 0,002% раствор, вазелиновое масло или керосин.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, шпатель, капельницы, стеклянная палочка, водяная баня с термометром или термостат, карандаш для стекла.