1.7 Форменные элементы крови и их значение

Кровь - это жидкая ткань, поэтому ее клетки не соединены друг с другом. Среди клеток крови рыб различают три основных типа - эритроциты, лейкоциты и тромбоциты [39].

Эритроциты. Эритроциты взрослых рыб имеют эллиптическую форму, а у молоди она округлая. В центре эритроцита имеется ядро, имеющее овальную форму. Благодаря наличию ядер эритроциты рыб обладают более высоким уровнем собственного обмена, время их жизни в норме весьма длительно - может превышать год. Размеры эритроцитов рыб в основном больше, чем у высших позвоночных. У хрящевых рыб эритроциты крупнее, чем у костистых. При нормальных условиях эритроциты находятся в кровообращении около 120 дней. Оболочка эритроцитов по структуре не отличается от оболочек других клеток и является трехслойной. Наружный слой состоит из белка гликофорина, который пропускает вещества из плазмы крови внутрь клетки. На внутренней стороне оболочки находится спектрин — другой значимый белок. Его основная роль заключается в сохранении формы эритроцита и способности менять ее на 3-4 мкм при прохождении через капилляры, с последующим восстановлением исходного очертания. Структура спектрина близка к структурам актомиозина, обуславливающего сокращение мышц, и тромбостенилина, ответственного за ретракцию создаваемого тромбоцитом сгустка. К спектрину присоединяется и молекула АТФ, которая расходуется в большом количестве при работе натриевого насоса, потребляющего более 50% вырабатываемой в эритроците энергии. Внутри этой тончайшей, в две молекулы, трехслойной оболочки находятся гранулы гемоглобина [21, 26].

Первая основная функция эритроцитов заключается в поглощении кислорода в жабрах и перенос его в капилляры тканей и в поглощении углекислоты в капиллярах тканей и доставка ее в жабры. Эта функция выполняется гемоглобином. Проникновение газов из эритроцитов в ткани и из тканей в эритроциты обеспечивается тем, что эритроциты в следствии малого диаметра капилляров проталкиваются через них поодиночке и тем, что в капиллярах ток крови резко замедлен. На первой фазе они несут неполную нагрузку гемоглобина; созревание завершается за один-три дня, в течение которых клетки безотказно выполняют функцию переноса кислорода. Во второй фазе зрелый эритроцит переносит кислород в одном направлении, а углекислый газ - в обратном, полностью выполняя свою функцию. На третьей фазе, при снижении эффективности их функции, они подбираются макрофагами, открывая путь молодым клеткам, вступающим в функциональный цикл [13, 21].

Вторая очень важная функция эритроцитов заключается в том, что они играют главнейшую роль в сохранении активной реакции крови. Эта функция также выполняется гемоглобином

Третья функция эритроцитов - поддержание ионного состава крови.

Четвертая функция эритроцитов - их участие в водном и солевом обмене.

Кроме того, эритроциты способны адсорбировать токсины, гормоны и продукты расщепления белков и, вследствие содержания в них ферментов участвовать в ферментативных процессах расщепления белков, жиров и углеводов [13].

Лейкоциты. Лейкоциты - это белые кровяные тельца. Количество лейкоцитов у рыб колеблется от десятков до сотен тысяч в 1 мкл. Количество их колеблется в больших пределах и зависимости от возраста, пола, стадии половой зрелости, упитанности, заболеваний, сезона года, температуры среды. Количество лейкоцитов может резко меняться в пределах одного вида, даже у одной рыбы в разные периоды жизни [3].

Лейкоциты делятся на гранулоциты, содержащие в цитоплазме особую специфическую зернистость - нейтрофилы, эозинофилы, базофил, и агранулоциты, цитоплазма которых не содержит зернистости, гомогенная - моноциты, лимфоциты [39].

Преобладающими клетками белой крови рыб являются лимфоциты, которые составляют до 95 % всех лейкоцитов. Большее количество лейкоцитов в сосудистой крови рыб, а также довольно быстрые смены состава их свидетельствуют о большей защищенности водных организмов, в сравнении с наземными позвоночными животными, от различных патогенных микроорганизмов, которых на единицу объема воды приходится значительно больше, чем на ту же единицу объема воздуха [3, 21].

Лейкоциты живут от 2-4 до 12-15 дней. Их главная функция - защита (фагоцитарная) организма от заразных микробов и отравлений [13].

Нейтрофил. Диаметр этих клеток у рыб от 5,5 до 7,5; у высших позвоночных 9,5-14,3 мкм. Цитоплазма слабо базофильная, содержит мелкие гранулы, которые красятся (по Паппенгейму) в серо-голубой цвет, довольно часто образует выступы [21].

Ядро в виде вытянутого в большей или меньшей степени валика зависит от возраста клетки. Валик иногда S - образно изогнут или разделен на три и более сегмента, соединенные тонкими перемычками. Созревание нейтрофила сопровождается постепенным уплотнением ядра, при этом хроматин укрупняется и концентрируется у оболочки. Наконец, образуются сегменты, хорошо проявляется специфическая нейтрофильная зернистость [21].

Нейтрофилы могут содержать в своей цитоплазме различные включения в виде зернышек гликогена, мельчайших жировых капелек и др. Это показывает, что нейтрофилы имеют определенное отношение к внутреннему обмену (то же можно сказать и про другие виды зернистых лейкоцитов) [21].

Функциональная активность циркулирующих нейтрофилов постоянно меняется. Обладая максимально выраженной двигательной активностью, они периодически выходят за пределы кровотока, куда больше не возвращаются и переходят в ткань. Здесь они фагоцитируют микробов, переваривают их, а также продукты распада клеток. Основной функцией нейтрофилов является, таким образом, защита организма от инфекции и одновременно - от токсических воздействий. Нейтрофилы вырабатывают ферменты бактерицидного действия. В то же время они не способны вырабатывать антитела, но, адсорбируя их на своей оболочке, доставляют к очагам инфекции. Функция этих гранулоцитов не ограничивается фагоцитозом и переносом антител. В процессе жизнедеятельности нейтрофилы выделяют ряд веществ, обладающих широким спектром действия. Одни вещества повышают бактерицидную активность клеток, улучшают регенерацию тканей, усиливают двигательную активность. Зрелые сегментоядерные нейтрофилы являются специализированными клетками. Они служат катализаторами многих энзиматических реакций. Характерно, что нейтрофил все функции начинает выполнять относительно зрелым, на стадии палочкоядерной формы. А завершается формирование всех внутриклеточных структур, обеспечивающих жизнедеятельность клетки, лишь на этапе зрелого сегментоядерного нейтрофила. На его оболочке увеличивается количество активных групп, несущих отрицательный заряд. На поверхности клетки формируется рецепторная система, обеспечивающая хемотаксис [21].

Сегментоядерные нейтрофилы - клетки, форма ядер которых разнообразна из-за того, что число сегментов неодинаково в разных клетках. Отдельные сегменты соединяются тонкой перемычкой или лежат особо.

Юные нейтрофилы почти не отвечают на хемотаксические стимулы, они с трудом меняют свою форму, но обладают способностью к пролиферации. Как установлено, в кроветворных органах многочисленные депонированные зрелые нейтрофилы, несмотря на почти полную морфологическую завершенность, своего функционального качества не достигают. Видимо, их «дозревание» происходит при выходе в циркулирующий ток крови, где концентрируются наиболее зрелые формы. Все это указывает на то, что в крови продолжается дифференцировка нейтрофилов и что они постепенно стареют. Самыми старыми являются клетки с наиболее дольчатыми ядрами [21].

Нейтрофилы, как и другие гранулоциты, - это специализированные клетки, утратившие способность к делению.

При патологических состояниях организма нейтрофилы выделяют в кровь вещества, обладающие бактерицидными и антитоксическими свойствами, могут оказывать стимулирующее действие на процессы регенерации в различных органах и тканях, осуществляют фагоцитоз иммунных комплексов антиген-антитело [21].

Нейтрофилы, являясь наиболее реактивными клетками крови, высокочувствительны к разнообразным изменениям внутренней среды, которые сопутствуют нарушениям гомеостаза во многих системах организма.

Все перечисленные формы гранулоцитов развиваются у рыб еще в эмбриональный период. На стадии появления у зародыша пигментации в глазах идет активный процесс пролиферации этих клеток, что подтверждается частым присутствием на мазках различных ядерных фигур митоза. К выклеву их количество значительно возрастает. Они отличаются не только морфологически, но и функционально.

Эозинофил. Эозинофилы - специализированные формы, в основном, правильно округлые клетки разного размера. У осетровых диаметр наиболее крупных клеток колеблется от 10 до 13, более мелких – от 7,5 до 9 мкм [21].

У многих видов костистых рыб диаметр эозинофила от 8 до 10 мкм, хотя у карпа он меньше - от 5,5 до 6,5 мкм. У высших позвоночных размер эозинофилов значительно больше - от 9,0 до 22,0 мкм [21].

Цитоплазма их слабо базофильная, с голубоватым оттенком. Компактное ядро расположено эксцентрично. У рыб оно иногда двухсегментное или многолопастное, напоминающее лист клена. Ядра эозинофилов отличаются разнообразием, отражающим возрастное состояние клеток. Усложнение формы ядра указывает на «взросление» клетки, далее - старость или болезнь [21].

Крупная зернистость эозинофилов обладает ярко выраженной ацидофилией. Среди рыб гранулы этих клеток имеют наибольшую величину у осетровых и окрашены у них в ярко-оранжевый или желтый цвет. У костистых рыб гранулы окрашиваются азур-эозином в красновато-розовый цвет. В процессе поэза, благодаря появлению в цитоплазме специфической зернистости, первой морфологически различимой клеткой является промиелоцит. Однако эозинофилопоэз имеет предшественниц, которые, видимо, проходят стадии более ранних бластных форм -миелобпастов. До сих пор нет полной ясности, на каком уровне клетка приобретает способность дифференцироваться в эозинофильном направлении [21].

По основным функциям гранулы эозинофилов могут рассматриваться как лизосомы. Активность ферментов по мере созревания эозинофилов возрастает: увеличивается количество энзимов, пероксидазы, гликогена, липидов и других внутриклеточных веществ. Сама клетка приобретает способность к амебоидному перемещению и фагоцитозу (эозинофильные промиелоциты не фагоцитируют), объектом которого являются не только бактерии, но и иммунные комплексы и продукты распада тканей. Фагоцитоз не является основной функцией эозинофила. Предполагают, что эти гранулоциты могут адсорбировать многие токсические продукты белковой природы и разрушать их. Они не обладают способностью синтезировать антитела, но адсорбируют антигены и переносят их в кроветворные органы. В какой-то мере эозинофилы имеют отношение и к процессу свертывания крови, синтезируя профибринолизин [21].

У рыб, по мере созревания особей, количество эозинофилов в крови увеличивается. Но основные функциональные свойства этих клеток реализуются, как и для большинства лейкоцитов, не только в токе крови, но и вне его - в периферических тканях. При этом хемотаксис гранулоцитов вызывается соединениями, выделяемыми лимфоцитами [21].

Количество эозинофилов - клеток экстремального реагирования - в течение суток меняется и резко реагирует на изменение абиотических факторов среды. Так, отклонения температурного и солевого режимов воды от оптимальных условий приводят у рыб к увеличению количества этих клеток. Наращивается их содержание и при поражении рыбы взрывной волной.

Доля эозинофилов среди клеток белой крови возрастает под влиянием тяжелых металлов. В процессе проявления аллергии - базовой защитной реакции - на первых ее стадиях идет наращивание этих гранулоцитов. В то же время, при хронических стрессах и тяжелых случаях токсикозов у рыб наблюдается эозинофилопения [21, 27].

Базофилы. Также являются специализированными, не способными к размножению формами. Этот вид клеток - реже всего встречающаяся популяция гранулоцитов в периферической крови и кроветворных органах, что чрезвычайно затрудняет их исследование. Принадлежность к базофилам выявляется по наличию специфических для них гранул, обладающих свойством метахроматической окраски. Зернистость характеризуется неравномерностью по величине и распределению в цитоплазме [21, 27].

Клетка базофила округлая. Ядро у рыб округлое, расположено эксцентрично, но у различных животных форма ядра иная. Из-за многочисленности гранул, которые заполняют цитоплазму, ядро плохо просматривается. Гранулы имеют вид крупных базофильных зерен, азур-эозином окрашиваются в темно-синий с красным оттенком цвет. За счет их некоторого выхода из клетки ее контуры кажутся несколько «растрепанными» [21].

Базофилы, как и эозинофилы, имеют некоторый суточный ритм: наибольшая их концентрация в крови отмечается ночью, наименьшая - утром. Полупериод нахождения этих клеток в крови составляет менее пяти часов. Вообще же, длительность жизни базофилов в периферическом русле не определена, как, впрочем, и дальнейшая их судьба [21].

Базофилы отличаются крайне медленной подвижностью и способностью к фагоцитозу (это свойство не является для них ведущим). Они захватывают частицы разрушенных эритроцитов, образуя при этом фагосому. Сенсибилизированные базофилы в фагосому выделяют содержимое гранул. Базофилы могут влиять на процесс свертывания крови, активизируют его за счет содержащихся в них веществ или вызывают гипокоагуляцию крови. При дегрануляции базофилов освобождаются факторы агглютинации тромбоцитов.

За счет гепарина, содержащегося в этих гранулоцитах, базофилы могут оказывать противоположный эффект на свертывающую систему. Эти клетки исследуются при изучении жирового обмена [21].

У рыб те или иные изменения химического состава воды приводят к грануляции зерен в базофилах. Так, у карпа при недостаточном поступлении кальция из внешней среды и длительном воздействии неблагоприятного фактора обнаружены клетки с дисфункцией базофильных гранул, что свидетельствует об участии базофилов в фагоцитозе [21].

Моноциты. Это клетки белой крови, которым посвящена обширная и довольно противоречивая литература. Взгляды на их происхождение, жизненный цикл, взаимосвязь и взаимоотношения с другими клетками многократно менялись. Название было предложено Паппенгеймом и Феррадо [21].

Моноциты - незернистые лейкоциты - обнаружены у всех исследованных рыб. Этот один из самых крупных элементов периферической крови (15-20 мкм) морфологически хорошо отделяется от других клеточных структур. Цитоплазма, лишенная гранул, слабобазофильная. По Паппенгейму она окрашивается в серо-голубой, серосине-лиловый цвет светлых оттенков. Ядро большое, бобовидной формы или овальное, расположенное эксцентрически. У незрелых форм клетка округлая, ядро стойкой нежной структурой хроматиновой «сети». Зрелые моноциты могут иметь неправильную форму. Чем клетка старше, тем грубее структура ядра. Цитоплазма старых клеток имеет вакуоли, которые придают ей вид лены (пенистая). Моноциты - активные фагоциты крови - поглощают не столько бактерии, сколько продукты распада клеток и тканей. Увеличение количества этих клеток в крови свидетельствует о повышении защитных сил организма. Во внеклеточную среду они постоянно секретируют лизоцим, накапливающийся в них по мере созревания моноцита. Лизосомам приписывается решающая роль в осуществлении внутриклеточной гибели инфекционных агентов и их переваривании [21].

Вырабатывая антитела, моноциты принимают участие не только в регуляции иммуногенеза, но и в регуляции гранулопоэза.

Существует также мнение о способности моноцитов инактивировать токсины. Они содержат специальные ферменты для дезинтоксикации некоторых веществ.

Моноциты, мигрирующие в ткани, дают начало макрофагам соединительной ткани (гистиоцитам), ряду органоспецифических макрофагов - клеткам Купфера печени, альвеолярным макрофагам легкого, макрофагам костного мозга, селезенки, тимуса, лимфатических узлов, полостей тела, центральной нервной системы (микроглии), остеокластам. При определенных условиях (в очагах воспаления) моноциты также могут трансформироваться в макрофаги [21].

Для рыб цитохимическим путем установлено, что макрофаги являются производными моноцитов. Попадая из кроветворного органа в кровь, часть моноцитов сохраняет способность к пролиферации. В результате происходит дифференцировка моноцитов в сторону макрофага [21].

Однако предполагают, что и специализированных макрофагов в тканях, способных к делению, недостаточно для поддержания их популяции. Осуществляется это путем постоянного притока моноцитов из крови и их преобразования в макрофаги.

Низкий процент моноцитов в лейкограмме не всегда является признаком благополучия. Они могут концентрироваться в очагах воспаления, трансформируясь здесь в макрофаги, что часто наблюдается при длительном воздействии неблагоприятных факторов среды [21].

Лимфоциты. Это сравнительно небольшие клетки округлой и несколько неправильной формы - у рыб от 5 до 12 мкм большую часть которых занимает ядро.

У молодых форм тонкая хроматиновая структура его окрашена в бледный фиолетово-розовый цвет; цитоплазма синяя, перинуклеарная зона хорошо выражена. У зрелых клеток ядро округлое, иногда наблюдается небольшая инвагинация, хроматин уплотнен, но не однороден, имеет глыбчатую структуру. В цитоплазме часто отмечаются выступы и впячивания. Нередко она образует узкий ободок вокруг ядра, который иногда вообще как бы отсутствует. У низших позвоночных такая клетка получила название голоядерной. Это состояние характерно для малых лимфоцитов. Кроме них, встречаются еще большие и средние лимфоциты, а также бластные клетки, которые формируются в результате трансформации малых. (Согласно унитарной теории, созданной крупным русским ученым А.А. Максимовым, малому лимфоциту вообще придается значение родоначальной клетки, которая является единственной для всех ростков крови). Исключено обратное превращение бластной клетки в малый лимфоцит [21].

У средних и больших лимфоцитов ободок цитоплазмы несколько шире, чем у малых, а в ядре хроматин менее плотный, с более выраженными ядрышками, хорошо заметна перинуклеарная зона. Лимфобласт характеризуется четкой базофилией. Цитоплазма более обильная, структура ядерного хроматина рыхлая.

У рыб малые лимфоциты - единственный тип белых клеток, регулярно и в большом количестве встречающихся в крови. Именно они придают крови лимфоидный характер. Эта многочисленная группа неоднородна морфологически и функционально. Бывают случаи, когда в узком ободке их цитоплазмы, лишенной, как правило, зернистости, просматриваются азурофильные гранулы, которые принимаются за липолитические ферменты [21].

При патологических случаях встречаются лимфоциты двух- и трех ядерные. Отмечается их сферуляция - процесс, носящий обратимый характер

Особое внимание уделяется изучению функциональной активности лимфоцитов. Это связано стой существенной ролью, которая принадлежит этим клеткам в реализации иммунологических реакций организма. Специализированные лимфоциты (Т- и В-лимфоциты, различающиеся по месту своего «рождения»), выполняющие эту функцию, морфологически неразличимы. В крови циркулируют лимфоциты, находящиеся во всех стадиях дифференцировки и происходящие от различных лимфоцитопроизводящих органов. Однако деятельность их всех без исключения направлена на «патрулирование» организма посредством иммунологического надзора.

Интересно, что потомки лимфоцитов обладают свойством иммунной памяти. Хотя в реакциях клеточного иммунитета участвуюв основном лимфоциты, такую же роль играют макрофаги (моноциты) и не исключено участие гранулоцитов [21].

Постоянно мигрируют между кровью и лимфой малые лимфоциты -иммунологически зрелые, длительно живущие клетки. Неоднородность малых лимфоцитов проявляется в том, что некоторые из них являются начальными клетками с активными потенциями, в то время как другие, морфологически сходные с первыми, наоборот, не способны эволюционировать и реагировать на различные стимулы, исходящие из «микроокружения» [21].

В крови значительная часть лимфоцитов относится к долгоживущим клеткам - продолжительность их жизни от нескольких месяцев до пяти лет. К короткоживущим относятся клетки с продолжительностью жизни от нескольких часов до пяти дней [21].

Тромбоциты. У рыб эти клетки отличаются большим непостоянством форм, размеров и количества. Они могут располагаться одиночно и скоплениями. Форма этих клеток может быть как минимум четырех видов - шиловидная, веретенообразная, овальная и округлая [3, 13].

Ядра у них темно-фиолетовые, иногда почти черные, круглые, слегка удлиненные, окружены заметным слоем грязно-розовой или серо-фиолетовой цитоплазмы. У тромбоцитов ядра очень уплотнены, и в зрелых клетках почти не просматривается их структура. Иногда они бывают двудольными или вообще бесформенными. Последние, как правило, являются дегенеративными формами; нередки случаи выпячивания ядра [21].

Размер тромбоцитов чаще всего близок к размеру ядра эритроцитов того же вида рыбы, но не исключено, что они бывают и крупнее. Средняя величина тромбоцитов 0,5-0,75 мкм определяется, как правило, образом жизни рыб (у малоактивных видов они несколько крупнее) [21].

У рыб значительная часть тромбоцитов депонируется в селезенке [21].

Среди исследователей крови существует единая точка зрения относительно функциональной значимости тромбоцитов. Эти клетки участвуют в процессе свертывания крови рыбы.

У рыб время свертывания - довольно не стабильный показатель, который зависит не только от способа взятия крови, но и факторов внешней среды, физиологического состояния рыбы.

Стресс-факторы повышают скорость свертывания крови у рыб, что свидетельствует о значительном влиянии центральной нервной системы на этот процесс.

В литературе описаны и межвидовые различия свертывания крови у рыб. Однако к этим данным стоит относиться с определенным скептицизмом, помня о том, что отловленная рыба - это рыба, подвергнутая резкому стрессу. Поэтому межвидовые различия, описанные в специальной литературе, вполне могут оказаться результатом различной устойчивости рыб к стрессам.

Таким образом, организм рыб надежно защищен от больших кровопотерь. Зависимость времени свертывания крови рыб от состояния нервной системы является дополнительным защитным фактором, поскольку крупные кровопотери возможны, скорее всего, в стрессовых ситуациях (нападение хищника, драки) [3, 13].

2 Материал и методика

Объектами исследования были линь (Tinca tinca L.) и окунь (Perca fluviatilis L.), а также их кровь, взятая у живых рыб. Сбор материала для определения гематологических показателей рыб проводился в 2007 - 2008 гг. в аквариальной кафедры «Аквакультуры» ФГОУ ВПО «КГТУ» и на оз. Виштынецком. Производители линя были отловлены в р. Неманин ставными сетями и 06.06.07 перевезены в аквариальную кафедры «Аквакультуры» ФГОУ ВПО «КГТУ», где осуществлялось их выращивание в экспериментальной УЗВ. Аквариальная предназначена для выращивания рыб и ведения научной деятельности. Она включает в себя два помещения: вентиляторная и основное помещение. В вентиляторной находится лабораторное оборудование: весы, ФЭК, различная лабораторная посуда, набор пипеток, реактивов, бинокуляр, стойка с аппаратами Вейса. Здесь осуществляется также хранение кормов. В основном помещении располагаются два стационарных бассейна, один из которых отстойник, два бассейна шведского типа, три пластиковых бассейна (объемом 300 л), спаренные аквариумы, аквариум для разведения живых кормов. Для подачи воздуха в выростные емкости используется компрессор. Также имеется набор переносных компрессоров. Для очистки воды используются биофильтры. Схема УЗВ представлена на рисунке 1.

1 - рыбоводные емкости; 2-биореактор; 3-U-образные уровневые трубки; 4-эрлифт; 5-биофильтр

Рисунок 1 – Схема УЗВ в аквариальной кафедры «Аквакультуры» ФГОУ ВПО «КГТУ»

Содержание производителей осуществлялось раздельно по полу в бассейнах. Биофильтр содержал четыре модуля биологической очистки, вода в которые подавалась при помощи помп. В качестве механических фильтров использовались снабженные губками помпы. Емкости для содержания рыбы были частично закрыты крышками, чтобы обеспечить необходимую для рыбы затененность и предотвратить выпрыгивание рыбы.

Регулярно проводилась очистка биофильтров и губок механических фильтров, чистка и частичная замена воды в выростных емкостях.

Кормили производителей кормом Aller Aqua два-три раза в день. Ежедневно измеряли температуру воздуха в рабочем помещении, а также температуру воды в выростных емкостях.

Лини на протяжении большей части эксперимента содержались при температуре 24-26ºС, что соответствует оптимальной температуре для роста, созревания и нереста этого вида. В период с 10.10.07 по 13.03.08 с целью имитации зимовки содержание производителей и ремонта линя осуществлялось при пониженных температурах (минимальная температура за этот период – 9,5ºС у ремонтного и 10ºС у маточного поголовья линя). На рисунке 2 изображен совмещенный график колебаний температуры воды и концентрации кислорода в УЗВ в период выращивания и содержания производителей линя.

Рисунок 2 – Динамика температуры воды и концентрации кислорода в бассейнах с производителями

Концентрация кислорода в экспериментальной УЗВ с производителями линя не опускалась ниже 5,56 мг/л, что соответствует благоприятным для линя значениям.

В УЗВ с двухгодовалыми особями линя, концентрация кислорода за период проведения эксперимента не опускалась ниже 6,27 мг/л, что соответствует благоприятным для рыб условиям.

В озере Виштынецкое сбор материала проводился 19-20 мая 2008 г. Окунь для исследований был выловлен ставными сетями на двух станциях, соответственно в 38 и 11 квадратах (рисунок 3), координаты которых указаны в таблице 2.

Таблица 2 – Координаты станций расположения ставных сетей в оз. Виштынецком

Номер станции	Начало сети		Конец сети
	широта	долгота	широта	долгота
1	54:25:43,4	22:43:09,1	54:25:30,3	22:43:22,4
2	54:26:55,8	22:42:23,2	54:26:46,5	22:42:13,3

Рис. 3 Расположение станций в оз. Виштынецкое

Во время отлова окуней температура воды в озере была 12°C, а содержание кислорода на ст. 1 – 11,32, на ст. 2 – 10,33 мг/л.

Всего была проанализирована кровь 5 экз. двухгодовалых линей и 9 экз. производителей линя в возрасте 4 года, 7 экз. окуня с первой станции в Виштынецком озере и 8 экз. – со второй станции.

Для сбора крови рыбу заворачивали в чистую марлю и с помощью скальпеля убирали слизь и чешую в месте взятия крови. Затем это место протирали ватным тампоном, смоченным 96% спиртом, и тщательно просушивали ватой. Иглой шприца делали прокол кожи по медиальной линии позади анального плавника и под углом 45° вводили иглу до позвоночника, где проходит ствол хвостовой артерии, иглой прорезали артерию и в шприц начинала поступать кровь

В качестве антикоагулянта применяли гепарин, которым предварительно ополаскивали шприцы, затем их высушивали [55].

Кровь для исследований брали в следующей последовательности:

1) перенесли кровь на часовое стекло;

2) приготовили мазок;

3) перенесли кровь в пробирки с консервирующим раствором;

4) перенесли кровь в трансформирующий раствор;

5) подсчитывали эритроциты в камере Горяева;

6) определяли гемоглобин на спектрофотометре;

7) фиксировали и окрашивали мазки крови;

8) определяли гемоглобин на спектрофотометре;

9) подсчитывали косвенным методом количество лейкоцитов;

10) определяли лейкоцитарную формулу [57].

Мазки приготавливали следующим образом: держа предметное стекло за узкие края переносили на него каплю крови. Другой рукой приставляли шлифовальное стекло узким краем к стеклу с кровью справа от капли под углом 45° и продвигали его влево до соприкосновения с кровью. Выжидали пока кровь расплывется по всему ребру шлифовального стекла и затем легким быстрым движением вели его слева направо до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. После приготовлений мазки сушили на воздухе до исчезновения влажного блеска [57].

Фиксировали и окрашивали мазки способом окраски по Паппенгейму. Предметные стекла ставили в киевский аппарат для массовой окраски мазков и заливали красителем-фиксатором Мая-Грюнвальда. Через 3 мин его заменяли рабочим красителем Романовского. Продолжали окрашивание в течение 15 мин, после чего краситель сливали, а мазки промывали водопроводной водой. Потом стекла ставили под углом для высушивания [57].

Определяли следующие показатели крови: концентрацию гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, общего белка в сыворотке крови, лейкоцитарную формулу, цитометрические характеристики эритроцитов.

Подсчет эритроцитов и лейкоцитов проводился с помощью камеры Горяева. Эритроциты считали в 5 больших квадратах камеры, а лейкоциты будут подсчитаны косвенным методом. Определяемую величину получали по формуле (1).

Х = , (1)

где Х- число клеток в 1 мкл крови; а – количество подсчитанных клеток; y – степень разведения крови; n – количество малых квадратов.

для эритроцитов:

Х_э = = а*12500;

для лейкоцитов:

Х_л = = а*2500 [53].

Для определения гемоглобина использовали гемиглобинцианидный метод на ФЭК с использованием ацетонциангидрина. Расчет содержания гемоглобина будет проводиться по формуле (2):

Hb, г/л = , (2)

где Е_оп – экстинция опытной пробы; Е_ст – экстинция стандартного раствора; С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе (59,75 мг%); К – коэффициент разведения крови; 0,01 – коэффициент для пресчета концентрации гемоглобина из мг в г*л ^-1 [53].

Концентрацию белка крови рыб определяют с помощью коэффициента преломления сыворотки на рефрактометре. Коэффициент преломления довольно точно свидетельствует о количественном содержании в сыворотке белка, которое определяется по таблице [53].

Концентрацию общего белка в сыворотке крови (в г*л ^-1) определяют по графику, используя найденный коэффициент преломления [53].

Подсчет лейкоцитарной формулы крови на окрашенных препаратах проводили с использованием светового микроскопа с применением иммерсии (увеличение 90х15, 100х15). На мазках подсчитывали 200 лейкоцитов по общепринятой методике. При идентификации лейкоцитов использовали классификацию клеток крови рыб Н.Т. Ивановой (1983). Подсчет лейкоцитарной формулы проводился по следующим группам лейкоцитов: нейтрофилы, среди которых выделяли: миелоциты нейтрофильные, метамиелоциты нейтрофильные, палочкоядерные нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы; псевдоэозинофилы, эозинофилы, псевдобазофилы, моноциты; малые и большие лимфоциты.

Окрашенные мазки изучали с помощью системы анализа изображений «ВидеоТест - Морфо», которая представляет собой автоматизированное рабочее место, предназначенное для проведения морфологического, стереологического и морфометрического анализа изображений со статистической обработкой полученных результатов. Мазок устанавливается под микроскоп, соединенный с TV-камерой. Телевизионный сигнал с TV-камеры передавался на плато ввода изображений и для визуализации на монитор видеоконтрольного устройства или видеоокно монитора компьютера. В плате ввода TV-сигнал оцифровывался, и изображение в цифровой форме передалось в ОЗУ компьютера для обработки и анализа. Программа позволила получить измерения различных параметров эритроцитов, провести статистическую обработку результатов, получить графики зависимости параметров [53].

Статистическую обработку полученных результатов выполняли по общепринятым методикам [1, 40, 47] в программе «Microsoft Exel 2003». Для расчета ряда показателей использовались стандартные статистические показатели, такие как: среднее значение - М, ошибка средней - m, среднеквадратическое отклонение - σ и коэффициент вариации - CV. Для подтверждения достоверности различий использовали критерий Стьюдента – St.