7.2.2. Визначення протеолітичних властивостей мікроорганізмів

Деякі мікроорганізми в процесі життєдіяльності виділяють протеази, які розщеплюють білки, що можна встановити по характеру зміни поживного середовища.

Наявність протеолітичних ферментів у мікроорганізмів, які вивчаються, пізніше можна визначити при засіві в стовпчик МПЖ. При температурі 22-23 ⁰С і витримці на протязі 24-48 годин, желатин розріджується, при чому форма цього розрідження різна – шарова, кратероподібна та воронкоподібна.

При засіві на молочний агар Ейкмана в чашку Петрі (10 частин стерильного розплавленого МПА і 3 частини стерильного знятого молока), роблять засів петлею і термостатують при 37 ⁰С на протязі 24-48 годин. Культури, що виділяють протеолітичні ферменти, викликають пептонізацію казеїну і утворення навколо колоній світлих зон на мутному фоні середовища. Культури аеробних мікроорганізмів засівають на сироватку крові в чашку Петрі, а анаеробних уколом в стовпчик сироватки крові і витримують при 37 ⁰С на протязі 24-48 годин. Штами, які продукують протеолітичні ферменти, розріджують поживне середовище і утворюють навколо колоній поглиблення.

Деякі види патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів з протеолітичною активністю, обумовлені здатністю розщеплювати білок до продуктів глибокого розпаду індола, сірководню, сечовини, аміаку.

Для диференціації різновидів патогенних мікробів найбільше значення має виявлення індолу та сірководню.

Індол утворюється внаслідок розщеплення триптофану. Для встановлення його наявності, в пробірку з МПБ або пептонною водою, засіяною досліджуваною культурою, підвішують смужку фільтрувального паперу, який попередньо насичений гарячим насиченим розчином щавельової кислоти. Якщо після витримки при 37 ⁰С на протязі 24-48 годин папір забарвлюється в рожевий колір або червоний, це свідчить про наявність індола.

Сірководень-кінцевий продукт розщеплення цистина, цистеїна і метіоніна. Для його виявлення в пробірку з засіяним МПБ підвішують смужку фільтрувального паперу, змочену 10%-ним розчином свинцю і висушену. До 10%-ного розчину оцтовокислого свинцю поступово додають 10%-ний розчин їдкого натру, поки утворений осад знову не розчиниться.

При виділенні сірководню, папір буріє або чорніє (утворюється сірчистий свинець).

Утворення сірководню і індолу, визначають одночасно, для чого в пробірку підвішують дві індикаторних аркуші.

7.2.3. Визначення сахаролітичних властивостей мікроорганізмів

Властивості розщеплювати вуглеводи і багатоатомні спирти, які об’єднують в одну групу цукри, притаманні багатьом умовно-патогенним і патогенним мікроорганізмам.

Під дією сахаролітичних ферментів бактерій, цукри розщеплюються до альдегідів і кислот. Кінцевими продуктами їх розщеплення є вуглекислий газ і водень.

Різні види і штами мікроорганізмів по-різному відносяться до цукрів.

Одні ферментують лактозу, інші - глюкозу, треті- і те і інше.

Цю властивість в мікробіології використовують для розрізнення видів бактерій.

Досліджувану культуру засівають в поживні середовища Гісса, які також називаються пёстрым рядом (або пёстрым рядом Гісса), що являють собою ряд пробірок з пептонною водою (1%-пептону), цукром (0,5-1%), повареною сіллю (0,3%) і індикатором Андрере (1мл індикатора на 100 мл середовища) або бромтимолбрау (0,1 мл 1,6%-ного розчину бромтилюлблау на 100 мл середовища).

Індикатор Андрере готують таким чином: 0,3 г кислого фуксину розчиняють в 100 мл стерильної дистильованої води і додають 16,4 мл 1 н. розчину їдкого натру. Розчин стерилізують при 100 ⁰С на протязі 5 хв і зберігають в темному місці у флаконі з притертою пробкою. Індикатор Андрере має солом’яно-жовте забарвлення. При зміщенні рН середовища в кислу сторону, він набуває яскраво-малинового забарвлення. Індикатор бромтимолблау дозволяє визначити зміну рН в межах 6,0…7,6. В лужній зоні (рН=7,6) індикатор має синій колір, в кислій зоні (рН=6,0) – жовтий. При зміні рН у вказаному діапазоні забарвлення приймає різні відтінки зеленого кольору.

Індикатор бромтимолблау готують слідуючим чином: 0,4 г бромтимолблау розчиняють в 40 мл дистильованої води, нагріваючи її до кипіння. Після цього до розчину додають 6,4 мл 0,1 н. розчину їдкого натру, в результаті чого рідина забарвлюється в зеленуватий колір і доливають дистильованою водою до 100 мл. Індикатор зберігають в темному місці в склянці з притертою пробкою .

Пёстрый ряд Гіса містить 5 пробірок: з глюкозою, лактозою, манітом, мальтозою і цукрозою. Для поглибленого аналізу пёстрый ряд Гіса доповнюють ще іншими цукрами: дульцитом, сорбітом, ксилозою, арабінозою. Цукор і спирти, які застосовують для середовищ, повинні бути чистими.

Для знаходження газів (кінцевих продуктів розпаду цукрів) в пробірки з рідкими середовищами Гіса опускають поплавок (трубка діаметром 0,5…0,7 см, запалена з одного кінця і перевернута догори дном). При стерилізації він повністю заповнюється живильним середовищем. При виділені в середовищі газоподібних продуктів у поплавку утворюється повітряна бульбашка різної величини і поплавок вспливає. Пробірки з набором середовищ Гісса ставлять у штатив у ряд, надписують номер пробірки і який цукор в кожній з них, і засівають досліджуваною культурою за допомогою бактеріологічної петлі. Середовища в штативі витримують в термостаті при 37…43 ⁰С на протязі 48-72 годин. Зміна кольору живильного середовища в пробірці позначають буквою К (кислотоутворення), а кислотоутворення з появою бульбашок газу в поплавці – буквами КГ, де Г вказує на утворення газу.