7. Проблема контаминации

Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это связано с наиболее острой проблемой метода - контаминацией.

Контаминация - попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе детекции из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки.

Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлением. Одним из них является использование фермента N-урацил-гликозилазы (УГ). В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием смеси дНТФ, в которой дТТФ заменен на дУТФ (урацил), и после термоциклирования все образующиеся в пробирке ампликоны будут содержать урацил. Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации.

Другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации.

Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция не идёт со 100% эффективностью и, соответственно, после инактивации продуктов амплификации из миллиардов копий амплифицированного фрагмента хотя бы несколько останутся целыми, что существенно снижает ценность такого подхода. Кроме того, всегда остается риск кросс-контаминации от образца к образцу в процессе пробоподготовки.

Таким образом, оба эти метода лишь в некоторой степени позволяют устранить источник контаминации и не гарантируют от ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Есть третий способ борьбы с результатами контаминации, рассматриваемый скорее как казусный - значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25-30 циклов). Но даже при таком подходе риск получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов велик.

Для уверенности в отсутствии контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать отрицательными контролями. В качестве отрицательных контролей рекомендуется использовать воду из комнаты пробоподготовки (после каждого десятого клинического образца желательно обрабатывать вместо биологического образца пробирку с водой).

Все реактивы рекомендуется хранить разлитыми на отдельные порции (аликвоты).

Если все же, несмотря на принятые меры, обнаружены следы контаминации, то все используемые порции реактивов следует заменить на новые, а все поверхности помещения, оборудования, пипеток и пр. необходимо обработать 0,1 М НС1, либо хлорсодержащими препаратами, например, ДП-2Т, рекомендуемым Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии.

За создание метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) Керри Мюллису в 1993 году была присуждена Нобелевская премия.

ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро размножить его. По сути дела метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю.

Метод включает несколько этапов: расплетание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках.

Для проведения такого процесса используют две генетические пробы (праймеры), которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры - это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15-30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Суть метода ПЦР отображена на рис. 28.

Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры около 100 град. С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые "стартовые" участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент - Taq-полимераза, устойчивая к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100град.С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть цепная реакция ПЦР.

В результате такого "тиражирования" за 2-3 часа количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Такого количества ДНК достаточно, чтобы визуально регистрировать с помощью простых приемов, которые давно используются молекулярными биологами.

Метод амплификации ДНК с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) оказал революционное влияние на генодиагностику. Для использования метода необходимо знать последовательность нуклеотидов на исследуемом участке ДНК.

Поскольку ДНК-полимераза не способна сама начать репликацию и может только достраивать комплементарную цепь к уже имеющемуся двухцепочечному участку, то сначала синтезируют два олигонуклеотида (так называемых праймера), комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, обычно отстоящих друг от друга на несколько сотен пар нуклеотидов ( рис. 65.7 ). Праймеры инкубируют с ДНК, намеченной для амплификации, и ДНК-полимеразой, которая, как известно, синтезирует комплементарные цепи в направлении 5'-3'. Специфичность реакции зависит от правильного выбора праймеров.

В ходе реакции последовательно меняют температуру: при температуре 90-95 градусов по С происходит разделение цепей ДНК, при температуре 40-60 градусов по С - присоединение праймера (отжиг), при температуре 72 градуса по С - синтез цепей ДНК.

В реакции используют термостойкую ДНК-полимеразу, которая не теряет активности в течение всей процедуры.

После ряда таких циклов, обычно 20-30 и более, образуются сотни тысяч копий исходной последовательности, расположенной между праймерами. Метод настолько чувствителен, что его можно использовать, например, для амплификации и анализа единственного участка ДНК из одного сперматозоида человека.

Для ПЦР пригоден минимально обработанный исходный биологический материал, даже частично разрушенный, что позволяет исследовать цельную кровь, пятна высохшей крови, смывы из ротовой полости, старые срезы ткани и другие образцы. Исходным материалом для ПЦР служит геномная ДНК или мРНК. В последнем случае из мРНК путем обратной транскрипции получают кДНК , которую затем используют в ПЦР, - так называемый метод ПЦР с обратной транскрипцией .

Метод ПЦР служит основой для дальнейших исследований амплифицированной последовательности:

- расщепления рестриктазами;

- гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами;

- определения нуклеотидной последовательности;

- исследования экспрессии in vitro с целью поиска мутаций, укорачивающих молекулу белка.

Различные модификации метода применяются для:

- синтеза одноцепочечной ДНК путем изменения соотношения олигонуклеотидных праймеров;

- создания рекомбинантных ДНК;

- исследования мутагенеза клонированной ДНК;

- сравнения экспрессии разных аллелей;

- выявления редких нуклеотидных последовательностей или ДНК возбудителей инфекции.

ПЦР можно провести всего за один день, ее легко автоматизировать, реакция сравнительно недорога и чрезвычайно специфична.

Принцип ПЦР заключается в чередовании циклов гибридизации одноцепочечных ДНК или РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами (праймерами), синтеза комплементарной нуклеотидной последовательности с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и денатурации образовавшихся двухцепочечных структур путем нагревания. За 20-30 циклов количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты достигает нескольких миллионов.

Для определения продукта реакции, как правило, используют хемилюминесценцию.

Использование ПЦР для направленного мутагенеза основано на применении в качестве праймеров олигонуклеотидов, не полностью комплементарных матричной ДНК. Повышенные требования к комплементарности накладываются лишь на последний, 3'-концевой, нуклеотид праймера, но даже в случае 3'-концевой некомплементарности праймеры часто продолжают функционировать в системе ПЦР, хотя и с разной эффективностью. Способность 17- нуклеотидного праймера инициировать ПЦР проявляется при наличии всего восьми нуклеотидов, комплементарных матрице, три из которых расположены на его 3'-конце.

Этот способ применяется для создания в амплифицируемом продукте новых сайтов рестрикции для последующего его клонирования и удобен для встраивания амплифицируемого продукта в экспрессирующий вектор в одной открытой рамке считывания (ОРС) с инициирующим ATG-кодоном вектора. Действительно, экспрессирующие векторы часто содержат 5'-концевую часть будущего рекомбинантного гена, включая регуляторные последовательности, промотор, ATG- кодон и иногда дополнительные кодоны нескольких последующих аминокислот. При конструировании таких векторов в последовательности, следующие за ATG-кодоном, вводят сайты рестрикции, по которым и встраивают фрагмент экспрессируемого гена, кодоны которого (для полноценной экспрессии гена) должны находиться в одной ОРС с ATG-кодоном вектора. Положение природных сайтов рестрикции в клонируемом гене редко отвечает требованиям ОРС вектора, поэтому вводят искусственные сайты рестрикции в клонируемый фрагмент с помощью праймеров, не полностью комплементарных матрице.

Вырожденные праймеры, которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов, содержащих многие точковые мутации, также используют для сканирования мутациями определенных участков ДНК. В таком классическом варианте постановки ПЦР, кроме точковых мутаций, можно получать делеции и вставки.

Дальнейшим усовершенствованием метода направленного мутагенеза с помощью ПЦР явилась разработка подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеров ( рис. II.18 ). Этот метод позволяет не только целенаправленно получать точковые мутации , делеции и вставки , но и гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы.

Методы клонирования ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - методика

В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).

К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических олигонуклеотида - праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из 3’-концов фрагмента ДНК. ДНК нагревают для разделения цепей двойной спирали, а при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплементарными участками фрагментов ДНК. В результате в растворе будут находиться однонитевые ДНК с короткими двухцепочечными участками - затравками (праймерами). При добавлении нуклеотидов и ДНК-полимеразы синтезируются комплементарные цепи и образуются идентичные фрагменты ДНК (первый цикл, рис. 43). Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием.

В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n — число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости (рис. 44). Таким образом, в процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами.

Первоначально для ПЦР использовали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Однако недостатком данного подхода являлось то, что после каждого цикла реакции необходимо было вносить в реакционную смесь новую порцию фермента. Кроме того, в оптимальных температурных условиях такой полимеразной реакции (37 °С) появлялись вторичные участки связывания праймеров и наблюдалась амплификация незапланированных сегментов генома, т. е. специфичность амплификации не была полной. Существенное улучшение метода полимеразной цепной реакции было достигнуто после замены фрагмента Кленова на ДНК-полимеразу термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза). Температурный оптимум реакции, направляемой Taq-полимеразой, находится в районе 70 °С. Другим важным свойством является то, что данная полимераза не инактивируется после длительной инкубации при 95 °С.

Используя Taq-полимеразу, удалось решить сразу две проблемы. Во-первых, термостабильная полимераза не инактивируется на этапе денатурации ДНК, и поэтому нет необходимости после каждого цикла реакции добавлять новую порцию фермента. Такое упрощение процедуры позволило автоматизировать проведение ПЦР, так как теперь требовалось лишь перенесение образца с определенным интервалом времени в разные температурные условия: 90—95 °С (температура денатурации) и 60—70 °С (температура ренатурации ДНК и ферментативной реакции). Во-вторых, высокий температурный оптимум реакции, катализируемой Taq-полимеразой, позволяет подбирать жесткие температурные условия отжига, обеспечивающие гибридизацию праймеров только в заданном районе изучаемого генома, что существенно повышает специфичность и чувствительность метода.

Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин. Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще большее усиление сигнала.

Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного фрагмента ДНК в составе векторных молекул.