Вопрос 1. Методы исследования клетки ( от Левингука до наших дней). Взаимосвязь развития техники микроскопии и уровня исследований.

Этапы познания клетки. Первый простой микроскоп появился в Голландии в конце ХVI в. Состоял он из трубы, прикрепленной к подставке, и имел два увеличительных стекла. Считают, что изобрели его в 1590-1610 гг. Ганс и Захариус Янсены - голландские мастера оптики. Роберт Гук (1635-1703), рассматривая в 1665 г. под усовершенствованным трехлинзовым микроскопом в сорокакратном увеличении тончайший срез пробки, открыл мельчайшие ячейки, похожие на такие же ячейки в меде, и дал им впервые название «клетки». А. Левенгук был первым человеком, который увидел животные клетки, начиная с 1674 г. он наблюдает мир микроорганизмов, 1676 г. - открытие бактерий; 1677 г. - сперматозоидов; 1680 г. - дрожжевых грибков; 1680 г. - красных кровяных телец у лягушки; 1681 г. - паразитирующих жгутиковых. Итальянский ученый Марчелло Мальпиги, делает целый ряд биологических открытий. Это он рассматривает клетки мозга, языка, селезенки, сетчатки, печени, нервов, кожи, капилляров, кровяные тельца, легкие лягушки, куриного зародыша и растительных тканей. Считалось, что в каждой зародышевой клетке находится полностью сформированный миниатюрный, но вполне готовый взрослый организм, который содержит в себе зародыши всех будущих поколений. Предполагалось, что развитие зародыша заключается только лишь в росте уже существующих органов. Была широко распространена «теория вложения», по которой утверждалось, что в яичнике Евы имелись готовые зачатки всех прошедших, настоящих и будущих поколений, т. е. организм представляет собой что-то вроде игрушки матрешки, в которую вложены такие же матрешки, последовательно уменьшающиеся в размерах. Вот эту теорию и опроверг Каспар Фридрих Вольф, вызвав резкие возражения современников. В 1825 г. чешский ученый Ян Пуркинье (1787-1869) открыл ядро в яйцеклетке птиц, а в 1831 г. английский ученый Роберт Броун (1772-1858), известный как выдающийся английский ботаник, специалист в области описательной систематики, в клетках кожицы орхидеи открыл ядро, которое потом нашел в клетках многих других растений. В 1837 г. тот же Ян Пуркинье обратил внимание на полужидкое студенистое содержимое, заполнявшее клетку, а в 1840 г. предложил назвать клеточное содержимое протоплазмой, убедившись в том, что именно оно, а не клеточные стенки, представляет собой живое вещество (позднее был введен термин «цитоплазма»: цитоплазма + ядро = протоплазма). Таким образом, в 30-х гг. XIX в. были накоплены конкретные представления о структурной организации клетки. Немецкий зоолог Теодор Шванн (1810-1882) стал первым ученым, который обобщил все эти знания и пришел к выводу, что клетка является тем микроскопическим элементом, из которого состоят все живые организмы. Чтобы убедиться в этом, Т. Шванн пригласил к сотрудничеству своего друга, немецкого ботаника Матиаса Шлейдена (1804-1881). В 1858 г. Р. Вирхов опубликовал свою теорию клеточной патологии, в основу которой была положена физиологическая самостоятельность каждой клетки в отдельности. Как ни странно, несмотря на ошибочность такого положения, работа Вирхова значительно продвинула вперед клеточную теорию и положила начало многочисленным исследованиям в медицине. Ведь ученый был прав, доказывая, что клетка, хоть больная, хоть здоровая, образуется исключительно делением существовавших до нее клеток, т. е. клетка может возникнуть только из предшествующей клетки в результате ее деления. - 1866 г. - Геккель установил, что хранение и передачу наследственной информации осуществляет ядро, т. е. установлены функции ядра. - 1866-1883 гг. - открыты пластиды, в частности хлоропласты. - 1890 г. - открыты митохондрии. - 1898 г. - Камилло Гольджи открыл органоид, получивший впоследствии название «минарет Гольджи». - 1900 г. - вновь открыты законы Г. Менделя, начинает развиваться цитогенетика. - 1930-е гг. - появился электронный микроскоп и стало возможным по настоящее время изучение ультраструктуры клетки.

Вопрос 2. Методы подготовки объектов в световой и электронной микроскопии. Интерпретация изображения, построение объемного изображения, факт и артефакт. Несмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале. Если клетку повредить, она начинает претерпевать ряд изменений, а после смерти клетки в ней активируются автолитические ферменты, что приводит к грубым изменениям клеточной структуры. Следовательно, задачи фиксации – это убить клетку, прекратить активность внутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежать потери структур и веществ, препятствовать появлению структур, отсутствующих в живой клетке (артефактные структуры). К сожалению, еще не найден такой химический фиксатор, который бы удовлетворял всем этим требованиям. Часто для фиксации используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты, вызывающие необратимую денатурацию белков, осаждение нуклеиновых кислот и полисахаридов. Осаждающим действием обладают такие сулемовые фиксаторы и фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокись осмия (OsO4), хорошо сохраняют липиды. После фиксации объекты в дальнейшем можно подвергать дополнительной обработке. Одной из главных таких обработок является окрашивание клеток. Именно дополнительное окрашивание клеток позволило выявить в них массу деталей. Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или с клетками культуры ткани можно непосредственно помещать в красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Изучают такие срезы и отдельных клеток. Для этого после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол – парафином. Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе, оказывается заключенной в твердую массу парафина, которую можно нарезать. Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе – микротоме. Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой. Теперь срезы можно окрашивать водными растворами красителей. Для изготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются в канадский бальзам под покровным стеклом, эти препараты можно длительно хранить. Для окраски фиксированных тканей и клеток применяют различные натуральные и главным образом синтетические красители. Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами (окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексные соединения (лаки). Синтетические красители подразделяют на кислые и основные. Основные краски представляют собой соли красящих оснований, содержащие в своем составе аминогруппы, которые и определяют их щелочность. Такие красители образуют солевые связи с кислотными группами в структурах клетки. Следовательно, участки клеток, богатые кислотными группами, свяжутся с основными красителями, будут, как их называют, базофильными. Кислотные красители содержат в своем составе гидроксильные группы, или группы SO2OH. Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются с кислотными красителями и называются ацидо- или оксифильными. Существует множество смесей таких красителей, которые одновременно могут окрашивать различные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастность клеточных и внеклеточных компонентов. Таким образом, используя всевозможные красители, исследователи не только добиваются четкости морфологической картины клетки, но получают некоторые сведения о химизме той или иной структуры. Ряд красочных приемов, направленных на выявление специфических химических веществ, получил название гистохимических и цитохимических. Методов цитохимического анализа очень много. Существует целый ряд специфических красочных приемов, прямо выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества. Примером такого рода цитохимических реакций может быть широко применяемая реакция на ДНК, реакция Фёльгена (рис. 8). Суть ее в том, что после специфического кислотного гидролиза только на ДНК в результате отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Эти группы могут взаимодействовать со специфическим индикатором , реактивом Шиффа (обесцвеченное основание фуксина), давая красное окрашивание в местах локализации ДНК. Связывание красителя в этом случае строго количественное, что позволяет не только обнаружить и указать места, где есть ДНК, но и измерить ее количество. Используя этот же принцип выявления альдегидных групп, можно в клетках видеть расположение полисахаридов после гидролиза их периодной кислотой (так называемая PAS-реакция). Также специфически можно определить локализацию белков реакциями на отдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.). Липиды и жиры обнаруживают в клетках специальными красителями (судан черный), хорошо растворяющимися и аккумулирующимися в жировых включениях. Целая группа цитохимических реакций связана с обнаружением ферментов. Общий принцип этих реакций в том, что в микроскоп видны не сами белковые ферменты, а места их локализации, которые обнаруживаются по продуктам их специфической ферментативной активности. Артефакт-структура, наблюдаемая в тканях под микроскопом, тогда как в живой ткани она отсутствует. Артефакты, возникающие вследствие недостаточной фиксации или неправильного размещения ткани под микроскопом, могут давать ложное впечатление наличия какого-либо заболевания или аномалии, тогда как в действительности оно отсутствует.