Дифузійні методи

Ця група методів базується на здатності антибіотиків дифундувати в агарових середовищах.

Метод з використанням металевих циліндриків. На поверхню живильного середовища в чашці Петрі, засіяного культурою тест-мікроорганізму, розставляють циліндрики (зовнішній діаметр 8 мм, внутрішній діаметр 6 мм і висота 10 мм) з алюмінію або нержавіючої сталі. Зазвичай 5-6 циліндриків на чашку. В одні циліндрики вносять досліджуваний розчин антибіотика, в інші – стандартний розчин того ж антибіотика з відомою концентрацією. Чашки поміщають у термостат на 20-24 год і вимірюють діаметри зон затримки росту тест-мікроорганізму. Облік результатів аналогічно методу розведень.

Метод лунок. У агаровій платівці роблять лунки діаметром 8 мм, використовуючи пробкове свердло. Вирізані блочки видаляють. В одні лунки вносять випробовуваний розчин, в інші – стандартний. Далі аналогічно методу циліндриків.

Метод дисків. На поверхню поживного агару, засіяного тест-мікроорганізмом, поміщають диски фільтрувального паперу, просочені випробовуваним розчином антибіотика. Паралельно накладають диски з відомою концентрацією антибіотика. Облік результатів аналогічно попереднім двом методам.

Турбідіметричні методи

В основу цих методів покладено логарифмічну залежність ступеню пригнічення росту від концентрації антибіотика. Суть методу полягає у вимірюванні концентрації клітин тест-мікроба, що утворюють певну оптичну щільність середовища в результаті росту в присутності невеликих кількостей антибіотика. При цьому повного пригнічення росту не відбувається, лише затримується темп росту, що і позначається на оптичній щільності бульйону.

Для визначення концентрації антибіотика в середовищі будують калібрувальну криву, використовуючи розведення стандартного розчину антибіотика. Для цього вимірюють каламутність, що відповідає певній концентрації. Величину каламутності, отриманої при вирощуванні культури в присутності певних розведень, зіставляють з калібрувальною кривою і таким чином знаходять концентрацію антибіотика в культуральній рідини. Каламутність вимірюють за допомогою фотоелектроколориметру.

ХІМІЧНІ І ФІЗИКО-ХІМІЧНІ МЕТОДИ

До них відносять колориметричні і спектрофотометричні методи. В основу колориметричних методів покладено принцип перетворення препарату або його окремих угруповань у забарвлені сполуки. При спектрофотометричних методах використовується властивість багатьох антибіотиків давати характерний спектр поглинання у видимому світлі або в ультрафіолетовій області.

ІМУНОХІМІЧНі МЕТОДИ

Для визначення малих концентрацій антибіотиків (близько 50-500 нг/мл) в сироватці крові людини або для виявлення можливого забруднення продуктів харчування тваринного походження залишковими кількостями антибіотиків застосовують високоспецифічні, чутливі та досить швидкі методи імуноферментного аналізу (ІФА).

Принцип ІФА: На твердій поверхні пластикової лунки сорбують антитіла до конкретного антибіотика. У цю лунку вноситься досліджуваний біологічний матеріал. Якщо в ньому міститься антибіотик, то він закріплюється на відповідних антитілах і залишається зв'язаним при промиванні. На цьому перша стадія закінчується. Це основна – "специфічна" стадія процесу. Наступні стадії потрібні лише для виявлення утворення імунного комплексу. На другій стадії аналізу в лунку вносять антитіла до цього ж антибіотика із заздалегідь прикріпленим до них ферментом. Це так званий кон'югат. Якщо в лунці є імунні комплекси, що утворилися на першій стадії процесу, то виникає "молекулярна ланцюжок", на кінці якого знаходиться фермент. На наступній стадії в лунку додається розчин безбарвної речовини – хромогену. Ця речовина набуває забарвлення після розщеплення її присутнім у лунці ферментом. Тобто, якщо всі елементи ланцюжка присутні, в лунці утворюється забарвлений комплекс. Якщо на першій стадії аналізу імунних комплексів не утворилося, то немає й усієї наступної частини "молекулярного ланцюжка", внаслідок чого хромоген не забарвлює розчин.