- •Новосибирский государственный медицинский университет применение ферментов в медицине
- •1. Энзимодиагностика
- •Функциональные и нефункциональные ферменты и причины изменения их активности
- •1.2. Повышение специфичности энзимологических исследований
- •1. Интерпретацией результатов исследований в свете клинической картины;
- •2. Выполнением набора тестов;
- •3. Определением изоферментов.
- •1.3. Множественные формы ферментов.
- •Лактатдегидрогеназа
- •Креатинкиназа
- •1.4. Единицы активности ферментов
- •1.5. Правила определения активности ферментов
- •1.6. Биохимические констелляции
- •Инфаркт миокарда
- •Повреждения нервной ткани
- •Панкреатит
- •Гепатит
- •Костная ткань
- •2. Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •2.1. Заместительная терапия
- •2.2.Удаление некротирующих тканей
- •2.3. Применение ферментов в лечении келлоидных рубцов
- •2.4. Фибринолитические средства
- •2.5. Ферменты как противовирусные препараты
- •2.6. Применение ферментов в комплексной противоопухолевой терапии
- •2.7. Системная энзимотерапия
- •2.8. Иммобилизованные ферменты и преимущества их применения
- •2.9. Ограничения к применению ферментных препаратов
- •3. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов Ферментные реагенты
- •Ферментные электроды
- •Автоматические анализаторы
- •Технология «сухой химии»
- •Иммуноферментный анализ
- •Тесты для контроля самоподготовки
2.9. Ограничения к применению ферментных препаратов
Ограничением в применении ферментных препаратов с лечебной целью является трудоемкость технологий и дороговизна получения чистых ферментных препаратов в кристаллическом виде, пригодном для хранения и применения.
Кроме того, при использовании ферментных препаратов приходится учитывать также и другие обстоятельства:
-
Ферменты - это белки, которые являются антигенами и в некоторых случаях могут вызвать нежелательную аллергическую реакцию;
-
Быстрым разложением введенных ферментов (белок немедленно захватывается клетками "мусорщиками" - макрофагами, фибробластами и др.). Следовательно, требуются большие концентрации препаратов, чтобы достичь нужного эффекта.
-
Однако, при повышении концентрации ферментные препараты могут оказаться токсичными.
Несмотря на то, то парентеральное применение ферментов по указанным выше причинам в определённой степени затруднено, все-таки, в тех случаях, когда удается преодолеть эти препятствия, ферментные препараты оказывают прекрасный лечебный эффект.
3. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов Ферментные реагенты
Ферменты как аналитические реагенты широко применяются в практике лабораторных исследований при определении содержания в биологических жидкостях различных веществ.
Для определения в исследуемом материале содержания вещества, в биологический материал вводят фермент, катализирующий превращение только этого вещества, создают оптимальные условия реакции (рН, температура) и регистрируют скорость реакции (по образованию продукта или по изменению кофермента). Затем определяют концентрацию искомого вещества по скорости реакции, используя калибровочный график. Применение ферментативных реагентов значительно увеличивает специфичность методов. В настоящее время ферментные реагенты применяются для определения содержания глюкозы, этанола, молочной кислоты и др.
Таблица 10
Ферменты, используемые в диагностических наборах для определения некоторых метаболитов
Исследуемый аналит |
Фермент |
Источник |
Мочевина |
Уреаза |
Бобы канавалии мечевидной |
b-D-глюкоза
|
Глюкозооксидаза, Гексокиназа |
Aspergillus niger, Дрожжи |
Мочевая кислота |
Уриказа
|
Печень свиньи
|
Эфир холестерина
|
Холестеринэстераза
|
Поджелудочная железа крупного рогатого скота |
Триглицериды |
Липопротеинлипаза |
Pseudomonas sp. |
Для определения содержания глюкозы используются – глюкозооксидаза и пероксидаза. Ферментативное с колориметрическим завершением определение содержания глюкозы заключается в том, что она в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется до глюконолактона.
Восстановленный кофермент ФАДН2 окисляется молекулярным кислородом с образованием эквимолярного количества перекиси водорода.
ФАДН2 + О2 ФАД+ + Н2О2
Под действием пероксидазы Н2О2 окисляет хромоген – о-толидин, который при этом меняет бесцветную окраску на голубую (интенсивность окрашивания пропорциональна содержанию глюкозы).
В качестве хромогенов могут быть использованы и другие реагенты (4(п-бензохинонмоноимино)-феназон, образующийся при взаимодействии фенола и 4-аминоантипирина, 4-аминофеназон, дианизид, йодистый калий и др.)
Ферментативный метод определения мочевины состоит из двух этапов. Первый этап - общий для всех уреазных методов, заключается в том, что под действием уреазы происходит гидролиз мочевины до аммиака.
уреаза
H2NC(O) NH2 2 NH3 + Н2О + СО2
На втором этапе определяется концентрация аммиака, образовавшегося на первом этапе. Для регистрация концентрации аммиака используют способы: взаимодействие с хромогеном (салицилат или фенол с гипохлоритом натрия), использование сочетанных ферментативных реакций (глутаматдегидрогеназа, глутаминсинтетаза, лейциндегидрогеназа), ион-селективных электродов с иммобилизированным ферментом (уреазой), рН-индикаторов (технология «сухой химии»).
Процедуры, связанные с использованием ферментных реагентов можно автоматизировать, что значительно повышает чувствительность и точность определения веществ. Для анализа различных веществ применяют два вида устройств с иммобилизованными ферментами – ферментные электроды и автоматические анализаторы.