- •Реферат
- •Перелік умовних позначень
- •Огляд літератури розділ 1
- •1.1. Виділення та ідентифікація біотехнологічно-перспективних штамів роду Nocardia
- •1.2. Використання представників роду Nocardia у деградації нафтових забруднень
- •1.2.1. Механізми споживання гідрофобних сполук мікроорганізмами
- •1.2.1.1. Роль поверхнево-активних речовин у асиміляції вуглеводнів
- •1.2.1.2. Гідрофобність клітин мікроорганізмів і споживання вуглеводнів
- •1.2.1.3. Міжфазне споживання гідрофобних сполук, якому сприяють поверхнево-активні речовини
- •1.2.1.4. Генетичні основи деградації вуглеводнів
- •1.2.2. Деградація аліфатичних вуглеводнів
- •1.2.3. Деградація ароматичних вуглеводнів
- •1.2.4. Деградація гетероциклічних сполук
- •1.2.5. Біодеградація складових нафти імобілізованими клітинами бактерій роду Nocardia
- •1.3. Біосинтез практично-важливих метаболітів
- •1.3.1. Представники роду Nocardia як продуценти антимікробних речовин
- •Антибіотичні речовини представників роду Nocardia
- •1.3.2. Біосинтез поверхнево-активних речовин
- •1.4. Використання поверхневого культивування для отримання цільових продуктів
- •1.5. Використання представників роду Nocardia у процесах біотрансформації
- •1.6. Дослідження біосинтезу нокобактину Nocardia farcinica ifm10152
- •Висновки до огляду літератури
- •Експериментальна частина розділ 2 матеріали і методи досліджень
- •2.1. Об’єкти досліджень
- •При рості на агаризованих середовищах штам n. Vaccinii к-8 на 24 год утворює колонії схожої структури та зовнішнього вигляду, зображено у таблиці. Культуральні ознаки штаму Nocardia vaccinii к-8
- •2.2. Культивування Nocardia vacсinii к-8
- •2.3. Визначення параметрів росту і синтезу поверхнево-активних речовин
- •2.3.4. Метод кількісного визначення поверхнево-активних речовин
- •2.4. Визначення хімічного складу пар за допомогою тонкошарової хроматографії
- •2.5. Статистична обробка експериментальних результатів
- •Розділ 3 вплив органічних кислот на синтез поверхнево-активних речовин штамом nocardia vacсinii k-8 за умов росту на гліцерині
- •3.1 Хімічний склад поверхнево-активних речовин Nocardia vaccinii k 8
- •3.2. Вибір попередників та синтез поверхнево-активних речовин залежно від моменту їх внесення
- •Залежність синтезу пар n. Vaccinii k-8 від моменту внесення та концентрації цитрату натрію
- •3.3. Визначення оптимальних концентрацій цитрату й фумарату натрію
- •Залежність синтезу пар n. Vaccinii k-8 від концентрації цитрату
- •Залежність синтезу пар n. Vaccinii k-8 від концентрації фумарату
- •3.4. Синтез поверхнево-активних речовин за спільного внесення органічних кислот
- •Синтез пар штамом n. Vaccinii k-8 під час спільного внесення фумарату й цитрату натрію
- •3.5. Вплив регуляції рН на синтез поверхнево-активних речовин
- •Вплив регуляції рН на вихід поверхнево-активних речовин n. Vaccinii k-8
- •3.6. Вплив якості інокуляту на синтез поверхнево-активних речовин за присутності попередників
- •Вплив якості інокуляту на синтез поверхнево-активних речовин n. Vaccinii k-8
- •Висновки до експериментальної частини
- •Розділ 4 охорона праці
- •4.1 Організація служби охорони праці в лабораторії
- •Аналіз виробничого травматизму
- •Санітарні умови праці на виробництві Мікроклімат
- •Загазованість
- •Запиленість повітря
- •Заходи захисту від шуму та вібрацій
- •Освітлення
- •Випромінювання
- •Висновки по матеріалам аналізу санітарних умов
- •4.2 Розрахунок штучної освітленості для науково-дослідної лабораторії Національного університету харчових технологій Загальне освітлення
- •Місцеве освітлення
- •Список використаної ліератури
- •Ксерокопії публікацій
2.3.4. Метод кількісного визначення поверхнево-активних речовин
Кількість ПАР в супернатанті (г/л) визначали ваговим методом після екстракції поверхнево-активних ліпідів модифікованою сумішшю Фолча. Культуральну рідину, отриману після культивування N. vaccinii K-8, центрифугували при 5000g протягом 20 хв для відділення біомаси. 25 мл супернатанту поміщали в циліндричну ділильну воронку об’ємом 100 мл,
Залежність
поверхневого натягу супернатанту
культуральної рідини від розведення
додавали 5 мл 1М HCl, воронку закривали пришліфованою пробкою і струшували 3 хв, потім додавали ще 4 мл 1М HCl і 16 мл суміші хлороформа і метанола (2:1) і струшували (з метою екстракції ліпідів) протягом 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишали в воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирали (органічний екстракт 1), а водну фазу піддавали повторній екстракції. При повторній екстракції до водної фази додавали 9 мл 1М HCl і 16 мл суміші хлороформа і метанолу (2:1) і проводили екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз, збирали нижню фракцію і отримували органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додавали 25 мл суміші хлороформу і метанолу (2:1) і здійснювали екстракцію, як описано вище, отримуючи органічний екстракт 3. В разі утворення фракції емульгатора її центрифугавали при 5000g протягом 10 хв, та нижню органічну фракцію додавали до органічного екстракту, а верхню водну фазу піддавали подальшій екстракції. Екстракти 1-3 змішували і упарювали на роторній випарній установці ИР-1М2 (Росія) при температурі 50ºС і абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси.
2.3.5. Емульгувальні властивості досліджуваних зразків визначали за наступним методом. Як субстрат для емульгування використовували соняшникову олію. До 2 мл культуральної рідини, додавали 2 мл олії та струшували упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год, як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражали у відсотках.
2.3.6. Якісна реакція на гліцерин. Для визначення залишкової кількості гліцерину в постферментаційній рідині проводили реакцію взаємодії культуральної рідини з гідроксидом міді.
При взаємодії гідроксиду міді з багатоатомними спиртами відбувається розчинення гідроксиду і утворюється комплексна сполука синього кольору.
2.4. Визначення хімічного складу пар за допомогою тонкошарової хроматографії
Для визначення хімічного складу ПАР проводили тонкошарову хроматографію на силуфолових пластинках фірми Kavalier чеського виробника (розмір 150∙150 мм та 75∙150 мм) у полярній та неполярній системах.
Підготовка систем для хроматографії. Полярну систему готували змішуванням хлороформу, метанолу і води у співвідношенні 65:15:2. Неполярна система складалася з гексану і діетилового ефіру у співвідношенні 2:1.
Приготування пластинок. Попередньо на пластинки нанесли лінії старту та фінішу на відстані 1,3 см від нижнього та верхнього країв відповідно. На лінії старту було позначено точки для нанесення проб.
Приготування камери для хроматографії. Камеру для хроматографії вистиляли зсередини по периметру фільтрувальним папером, добавляли систему та накривали скляною кришкою. Камера готова до хроматографії, коли фільтрувальний папір повністю змочений системою.
Приготування барвників. Готували розчин наступних барвників:
-
фосфо-молібденової кислоти для виявлення нейтральних ліпідів (5% у етанолі). Для цього 1,25 г кислоти розчиняли у 25 мл етанолу. Виявлення ліпідів за допомогою фосфомолібденової кислоти базується на утворенні комплексної сполуки жовтого кольору.
-
нінгідрину – для вивлення пептидоліпідів та білків (1% у етанолі). Для цього 0,25 г кислоти розчиняли у 25 мл етанолу. Під час реакції нінгідрину з α-амінокислотою утворюється комплексна сполука синьо-фіолетового кольору (пурпур Руеманна).
+ =
Нінгідрин α-амінокислота пурпур Руеманна
- антроновий реактив – для виявлення гліколіпідів (0,5 г антрону розчиняли у 25 мл концентрованої сульфатної кислоти та доводили до об’єму 50 мл метанолом). Метод базується на дегідратації вуглеводу сильною кислотою з утворенням фурфуролу, та реакцією комплексоутворення останнього з антроновим реактивом
Комплексна
сполука
вуглевод фурфурол
Розчинення препарату ПАР. У круглодонну колбу з попередньо отриманим препаратом ПАР (культивування N. vacсinii К-8 у на середовищі №1 – проба 1, та з додаванням 0,5% розчину цитрату натрію – 2 і 3) добавляли 10 мл дистильованої води і перемішували для розчинення ПАР. Потім добавляли 10 мл суміші Фолча і екстрагували. Нижню фракцію відділяли шприцем і переносили в іншу колбу (екстракт 1). До колби з ПАР добавляли ще 5 мл суміші Фолча, повторно екстрагували, аналогічно відділяли нижню фракцію і добавляли до екстракту 1. Екстракт 1 випарювали на роторній випарній установці і наносили на пластинку для хроматографії.
Хроматографія на пластинках. На підготовлені пластинки наносили кінчиком піпетки проби. Пластинку поміщали у камеру для хроматографії,
заповнену системою розчинників. Витримували пластинку в камері доки система не піднімалася до лінії фінішу.
Проявлення пластинок. Пластинки обробляли барвниками та проявляли у сухожаровій шафі при температурі 100-120ºС протягом 15-20 хв.
Ідентифікація. Після проявлення хроматограм обчислювали значення коефіцієнту розподілу – відношення відстані, що пройшла дана сполука до відстані, що пройшов розчинник від лінії старту до лінії фінішу (Rf=lреч/lзаг ) для кожної виявленої сполуки, та порівнювали з табличними значеннями для відомих речовин [44].