Изменение микрофлоры полости рта на ранних стадиях ортодонтического лечения на несъемной аппаратуре

Изменение микрофлоры полости рта на ранних стадиях ортодонтического лечения на несъемной аппаратуре.

Автореферат из диссертации К.М.Н. ЛЕВКОВИЧ, Дарьи Владимировны. Защищенная в Санкт-Петербурге в 2011 году.

Работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Библиографический список литературы содержит 130 отечественных и 167 иностранных источников. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 13 рисунками.

Выполнил:

Врач-ординатор 1-ого года кафедры ортодонтии,

Наджафов Рамин Фаиг оглы.

Автореферат

Актуальность темы.

Наличие в полости рта ортодонтического аппарата ухудшает условия для ее самоочищения, осложняет уход за зубами и создает условия, благоприятствующие отложению мягкого зубного налета. В связи с этим отмечается высокое микробное обсеменение поверхностей зубов и ортодонтических аппаратов с покрытием их обширным мягким налетом [Хамитова Н.Х., 1986; Горонкина С.М., 1996; Sukontapatipark W. et al., 2001], что, в свою очередь, ухудшает процессы реминерализации эмали и ведет к нарушению ее структуры. Также наблюдается значительное изменение состава микрофлоры полости рта, которое проявляется увеличением числа патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, явлениями дисбактериоза [Ростокина Е.Б., 1979; Карницкая И.В., 1999]. Перечисленные факторы способствуют повышению распространенности кариеса зубов и воспалительных заболеваний пародонта [Перова Е.Г., 2000; Арсенина О.И. и др., 2005; Perinetti G. et al., 2004; Sallum E.J. et al., 2004; Speer C., 2004].

Несмотря на очевидную актуальность, проблема распространения условно-патогенных и патогенных микроорганизмов при лечении зубочелюстых аномалий на несъемной ортодонтической аппаратуре остается недостаточно изученой. Современные генетические исследования показали, что 95-99% нормальной микрофлоры пока неизвестны и не поддаются культивированию. Кроме бактерий в полости рта находятся археи, грибы, простейшие и различные вирусы [Samaranayake L.P, 2006; Quivey R.G. Jr., 2006]. Особенности существования микроорганизмов в различных биотопах полости рта тесно связанны с их способностью образовывать стойкие микробные сообщества, получившие название биопленки.

Биопленка является идеальной нишей для обмена генетической информацией между бактериями. Передача генов в биопленках наблюдается в 10-500 раз чаще, чем в планктонных клетках [Li Y.H. et al., 2001; Wuertz S., 1999; Roberts A.P. et al., 1999; Ghigo J. M., 2001]. В биопленке происходит ускоренный горизонтальный перенос генетического материала и она становится совершенной средой для появления микроорганизмов с новыми патогенными свойствами, устойчивостью к антимикробным препаратам и способностью к выживанию в различных условиях. Перераспределение генов в микробных биопленках полости рта приводит к формированию штаммов устойчивых к антисептикам/дезинфектантам и антибиотикам [Stewart P.S., 2002; Keren T., Shah D., Spoering D., Kaldalu N., and Lewis K., 2004].

Свойства бактерий биопленок объясняют, почему стандартная терапия часто не способна справиться с бактериями, в результате чего после завершения курса лечения они способны размножаться и вновь диссеминировать, приводя к формированию обострений и хронизации инфекции.

Особенности действия антимикробных препаратов на бактерии биопленок, формирующихся при ортодонтическом лечении несъемной аппаратурой, остаются практически не изученными. Профилактика распространения инфекции в полости рта и борьба с колонизацией бактериями, способными вызывать воспалительные заболевания полости рта и соматическую патологию, остается чрезвычайно актуальной.

Цель исследования.

Повысить эффективность мер профилактики распространения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов у пациентов с зубочелюстными аномалиями; при ортодонтическом лечении несъемной аппаратурой.

Задачи исследования.

1. Изучить микрофлору зубодесневой борозды у пациентов с различными формами зубочелюстных аномалий до установки ортодонтической аппаратуры и в ходе лечения. Дать характеристику биологических свойств микроорганизмов.

2. Выявить встречающиеся устойчивые микробные биопленки. Определить строение возбудителей стабильных микробных биопленок, выявленных у пациентов при использовании несъёмной ортодонтической аппаратуры.

3: Провести сравнительную оценку клинической эффективности; антимикробных препаратов в условиях эксперимента.

4. Предложить схемы профилактики и антимикробной терапии с учетом анализа данных исследования микробных биопленок.

Научная новизна.

Воздействие на внеклеточную ДНК матрикса микробных биопленок приводит к изменению их свойств. Создаются условия для повышения; эффективности антимикробной терапии воспалительных процессов полости рта у пациентов,, проходящих лечение на несъемной ортодонтической аппаратуре. О особенностями выживания бактерий в биопленках в значительной степени- связана неэффективность антимикробной терапии и хронизация* инфекции в стоматологической практике. Результатом низкой эффективности уничтожения микробных биопленок является их длительное существование в; организме, в том числе в полости рта, и, как следствие, возможность оказывать постоянное влияние на состояние здоровья человека. Таким образом, немногочисленные сообщения в литературе о роли применения антимикробных препаратов, проникающих в микробные биопленки, послужили основанием для проведения клинических исследований.

Положения, выносимые на защиту:

1. Формирование микробного пейзажа полости рта анаэробными и аэробными микроорганизмами до начала лечения на несъемной ор-тодонтической аппаратуре и выявление устойчивых микробных биопленок на ранних стадиях ортодонтического лечения на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры.

2. Качественная и количественная оценка возбудителей стабильных микробных биопленок, способных изолироваться от внешней среды, выделенных с поверности несъемной аппаратуры у пациентов, проходящих ортодонтиче-ское лечение.

3. Антимикробные препараты, содержащие ДНКАзу, способные проникать внутрь микробных биопленок. Профилактические и лечебные схемы этиотропного воздействия, позволяющие учитывать индивидуальную чувствительность бактерий и дающие возможность уменьшить количество осложнений и улучшить результаты лечения.

Практическая значимость.

Полученные данные об образовании устойчивых микробных биопленок на поверхности слизистой оболочки полости рта и несъемной аппаратуре (брекетах) ортодонтических пациентов послужили основанием для разработки эффективных схем применения антимикробных препаратов. Включение в комплекс профилактических и лечебных мероприятий методов этиотропного лечения, разработанных на основе чувствительности бактерий биопленок, позволит уменьшить количество осложнений и улучшить результаты лечения.

Внедрение в практику.

Разработанные лечебно-профилактические мероприятия по снижению образования устойчивых микробных биопленок на поверхности слизистой полости рта и несъемной аппаратуры у пациентов с зубочелюстными аномалиями внедрены в практику стоматологической клиники «Стомус» г. Санкт-Петербурга, а также используются при проведений лекций и семинаров для врачей и интернов на кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний, кафедре терапевтической стоматологии СПбГМУ им. академика И. П. Павлова, При проведении научных исследований на кафедре челюстно-лицевой хирургии СПбГМУ им. академика И.П. Павлова.

Апробация, работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

• II Международный молодежный медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные . чтения» (Санкт-Петербург, 2007);

• III Международный медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2009);

• ЬХУШ Конференция «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» (Санкт-Петербург, 2007);

• Международная конференция «Современные методы диагностики и лечения стоматологических заболеваний» (Воронеж, 2010);

• Всероссийская стоматологическая конференция «Новейшие технологии в стоматологии» (Краснодар, 2010).

Объем и структура работы.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК - 3.

Работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Библиографический список литературы содержит 130 отечественных и 167 иностранных источников. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 13 рисунками.

Заключение диссертации

1. Среди микроорганизмов, обнаруженных в зубодесневой борозде у пациентов с различными зубочелюстными аномалиями без видимых признаков воспаления тканей пародонта, выделены аэробные бактерии Neisseria spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp.,. Staphylococcus spp., Candida spp. — 60%, и анаэробные бактерии Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp.,. Veillonella spp., Actinomyces spp. и др. — 40%. Через 4-6 недель после установки несъемного ортодонтического аппарата на его поверхности доля анаэробных бактерий уменьшилась до 22%, а через 12 недель составила 6% от выделенных микроорганизмов. Количество аэробных микроорганизмов, способных вызывать воспалительные заболевания слизистой оболочки полости рта, через 12 недель после установки возросло до 94%.

2. Выявленные устойчивые смешанные микробные биопленки, включающие: Fusolactobacterium spp., Veillonella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Neisseria spp., Candida spp., Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp. образующиеся на поверхности несъемной ортодон-тической аппаратуры, имеющие классическое строение и включающие в себя микробные организмы и внеклеточный матрикс. В составе последнего, во всех изученных штаммах обнаружена внеклеточная ДНК, участвующая в поддержании структуры и поддержании и передаче генетической информации.

3. Препарат мультицид в концентрации 250 мг/л совместно с ДНКазой1 10 мг/л обладает способностью в 10 раз большей к разрушению биопленок, сформированных на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры и превосходит по своей эффективности антисептик — хлоргекседин в общепринятой концентрации (2000 мг/л).

4. Использование пациентами, проходящими лечение на несъемной ортодонтической аппаратуре, геля на основе антисептика мультицид и ДНКазы1 способствует улучшению гигиены полости рта, снижению воспалительных заболеваний полости рта, снижению микробной об-семененности зубов, что связано со способностью ДНКазы1 воздействовать на внеклеточную ДНК матрикса микробных биопленок, образующихся на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ:

1. Для профилактики осложнений заболеваний твердых и мягких тканей полости рта перед началом ортодонтического лечения у пациентов с зубочелюстными аномалиями необходима санация полости рта, а также проведение профессиональной гигиены полости рта перед установкой несъемной аппаратуры и 1 раз в три месяца на всех этапах ортодонтического лечения.

2. При лечении с помощью несъемной ортодонтической аппаратуры рекомендовано использование индивидуальных средств гигиены с периодическим микробиологическим контролем качественного и количественного состава микрофлоры полости рта, один раз в три месяца.

3. В качестве антимикробной терапии рекомендовано назначать использование мультицида 250мг/л в сочетании с ДНКазой! 10 мг/л в форме геля начиная со второй недели ортодонтического лечения на несъемной ортодонтической аппаратуре, и 1 или 2 раза в день после чистки зубов без последующего ополаскивания полости рта, курсом 7 дней (один раз в три месяца).

ГЛАВА 6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Ортодонтия, важнейший раздел стоматологии, изучает этиологию и патогенез зубочелюстных аномалий у человека, а также подходы и методы, устраняющие эти патологии в различных возрастных группах. В современной стоматологии ортодонтия стала связующим звеном, краеугольным камнем между многими разделами не только в стоматологии, но и между общедисциплинарными предметами, такими как терапия, хирургия, оториноларингология, общая ортопедия, акушерство и гинекология, педиатрия. Современные подходы к лечению стоматологических пациентов редко обходят своим вниманием ортодонтию. И это легко понять, так как в основе множества стоматологических заболеваний лежат нарушение прикуса и неправильное положение зубов, а также дисфункции ВНЧС. В связи с этим ортодонти-ческая помощь (лечение) стали сегодня актуальны. Следует отметить, что современная ортодонтия располагает различными методами и способами лечения практически всех возрастных групп пациентов, начиная с раннего детства (0-3 года), до лиц преклонного возраста (60 и более лет).

Это стало возможным с развитием высоких технологий при изготовлении ортодонтической аппаратуры как съемной, так и несъемной. Приход цифровых технологий в* рентгене и компьютерной томографии радикально изменил к лучшему диагностику и планирование лечения в ортодонтии.

На сегодняшний день не представляется возможным качественно проведенное лечение пародонтологических и ортопедических пациентов без участия врача-ортодонта, обладающего современными взглядами и знаниями, работающего авангардными методами и аппаратурой. Исходя из этого понятна актуальность проведенного исследования. Количество пациентов, проходящих лечение на несъемной аппаратуре (брекет-системах) возрастает с каждым годом.

Многие факторы окружающей среды влияют на состав, биологическую активность и патогенность микроорганизмов, способных обитать в полости рта человека. Установлено, что различные виды лечения заболеваний полости рта могут сопровождаться распространением патогенных микроорганизмов. Показано также, что использование несъемной аппаратуры значительно затрудняет поддержание нормальной гигиены, способствует образованию зубной бляшки и формированию новых зон ретенции зубного налета, что-предрасполагает к размножению и распространению микроорганизмов. В свою очередь, с увеличением числа зубных бляшек и распространения в них различных микробов, включая грибы рода Candida spp., связывают появление гингивитов и склонность к поражению пародонта. В наших исследованиях показано, что при использовании несъемной аппаратуры в полости рта происходит изменение состава нормальной микрофлоры. В связи с этим, целью настоящего исследования было качественное и количественное изучение состава микроорганизмов, колонизующих использующуюся при ортодонтическом лечении несъемную аппаратуру, а также десневую борозду.

В результате изучения микрофлоры при лечении с использованием несъемной аппаратуры установлено, что на протяжении всего срока наблюдения (12 недель) происходит изменение микрофлоры десневой брозды и формирование биопленок на поверхности несъемной аппаратуры. У обследованных выявлено появление в биопленках значительного количества энтеI робактерий и грибов рода' Candida spp. . Подобная1 тенденция совместного распространения грамотрицательных бактерий и одноклеточных грибов наблюдалась и ранее, что свидетельствует о формировании сложных биопленок, включающих неродственные микроорганизмы. Ранее установлено, что ортодонтическое лечение с использованием съемной и несъемной аппаратуры приводит к увеличению числа зубных бляшек и образующих их бактерий. При этом показано, что большие изменения возникают при использовании несъемной аппаратуры. Состав формирующейся микрофлоры, свидетельствует об увеличении опасности развития' у пациентов гингивита и пародонтита. Выявленные нами на поверхности несъемной аппаратуры и в десневой борозде микроорганизмы являются потенциальными возбудителями поражений пародонта (Peptostreptosoccus spp., Fusobacterium spp., Veillonella spp., Staphylococcus spp., Sreptococcus spp., Neisseria spp., Bifidobacterium spp., Corynebacterium spp.), слизистой оболочки полости рта (Staphylococcus spp., Sreptococcus spp., Neisseria spp., Candida spp.) причиной галитоза (Peptostreptosoccus spp., Fusobacterium spp.), а также ряда соматических заболеваний. Вновь сформированные на поверхности аппаратуры микробные биопленки, как и все микробные сообщества, отличаются от изолированных клеток по эффективности действия на них различных противомикробных препаратов -антисептиков и антибиотиков. Очевидно, что при этом меняется и действие продуктов микробной природы, влияющих на состояние организма человека, в том числе и на вероятность возникновения новых поражений полости рта.

Полученные в настоящей работе данные указывают, что в ходе лечения, в связи с распространением бактерий, образуются новые сложные микробные биопленки и формируются условия для возникновения различных поражений полости рта. Для предотвращения развития новых заболеваний на фоне ортодонтической терапии необходима разработка специальной профилактики для предотвращения усиления микробной колонизации поверхности несъемной аппаратуры и десневой борозды.

Использованные штаммы бактерий, относящиеся к представителям нормальной микрофлоры полости рта, изолированные у пациентов с несъемной аппаратурой при ортодонтическом лечении, образовывали моно- и смешанные биопленки. Следует отметить, что полученный штамм Streptococcus mitis хорошо формировал биопленки в выбранных условиях, в то время как Neisseria subfiava как монокультура росли плохо. В то же время, в присутствии выбранного штамма Streptococcus mitis и Neisseria subfiava формировали устойчивую смешанную биопленку.

В матриксе полученных биопленок была обнаружена внеклеточная ДНК. Во всех изученных пробах матрикса, полученного из моно и смешанных биопленок, присутствует внеклеточная ДНК с молекулярной массой, примерно, 30 Кб:

Использованный метод электрофоретического разделения в агарозном геле не показал различий в величине фрагментов ДНК матрикса, полученных из микробных биопленок, образованных монокультурой Streptococcus mitis и смешанных сообществ, сформированных Streptococcus mitis и Neisseria sub-flava. Внеклеточная ДНК, выделенная из смешанных биопленок, при электрофорезе в геле идет единым, не разделенным фронтом, не отличимым от фрагментов, обнаруженных в сообществах, сформированных бактериями одного типа. После обработки ДНКазой1 наблюдалось полное исчезновение полосы, соответствующей 30 кб, полученной после фенольно-хлороформной экстракции из матрикса, что подтверждает природу данной молекулы как ДНК.

Добавление антисептиков и/или ДНКазы изменяло изученные свойства биопленок. В экспериментах были использованы хлоргексидин — 2000 мг/л, мультицид - 250 мг/л и ДНКаза1- 10 мг/л. Концентрация хлоргексидина была выбрана как одна из наиболее используемых в стоматологии. Количества мультицида и ДНКазы 1 были заведомо ниже, поскольку препараты находятся в стадии изучения. Снижение биомассы, зафиксированное фотометрически, обнаружено у всех типов биопленок в присутствии мультицида и ДНКазы!. Хлоргексидин обладает собственным поглощением в диапазоне использованных длин волн, что делает невозможным объективную оценку данного показателя. Установлено, что уменьшение количества внеклеточного матрикса указывает на увеличение доступности клеток микробных биопленок по отношению к внешним воздействиям. Представляется, что аналогичная ситуация имеет место и при использовании антисептиков. Обращает на себя внимание, что в пределах использованных концентраций антисептиков и ДНКазы!, максимальное снижение биомассы зарегистрировано в присутствии фермента, действующего на внеклеточную ДНК.

Уровень снижения оптической плотности в присутствии ДНКазы мало различался в биопленках, образованных Streptococcus mitis и смешанной культурой Streptococcus mitis + Neisseria subflava.

Использованные антисептики показали высокую активность по отношению к микробным биопленкам и вызывали в них значительное снижение числа КОЕ. При действии хлоргексидина число КОЕ в биопленках, образованных Streptococcus mitis или их ассоциацией с Neisseria subßava снижалось на 6 порядков. Мультицид в этих же условиях снижал число КОЕ на 4 порядка. Вместе с тем, эти данные не позволяют напрямую сравнивать два антисептика между собой, поскольку мультицид был использован в концентрации в 10 раз меньшей, чем хлоргексидин. Полученные результаты позволяют констатировать эффективное действие испытанных антисептиков на бактерии биопленок использованных штаммов. В присутствии ДНКазы1 также было зарегистрировано незначительное снижение числа КОЕ. Совместное использование антисептиков и ДНКазы1 при действии на сформированные бактериальные биопленки приводило к потенцированию антимикробного действия. Хлоргексидин и ДНКаза1 в использованных концентрациях приводили к эрадикации микробных биопленок. Совместное использование муль-тицида и ДНКазы1 увеличивало антимикробную активность в 10 раз по сравнению с действием одного антисептика.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что бактерии, относящиеся к нормальной микрофлоре полости рта, выделенные с поверхности зубов и несъемной аппаратуры при ортодонтическом лечении, в выбранных условиях образуют устойчивые микробные биопленки. В матриксе микробных биопленок, сформированных моно- и смешанными культурами, присутствует внеклеточная ДНК размером около 30 кб. При действии на микробные биопленки использованных антисептиков и ДНКа-зы1, в них происходит уменьшение биомассы и числа КОЕ. Максимальное снижение биомассы происходит в присутствии ДНКазы1. Совместное использование антисептиков и ДНКазы1 приводит к значительному усилению антимикробного действия.

По данным клинических исследований достоверно было обнаружено, что в исследуемой группе, применявшей антисептик мультицид в сочетании с ДНКазой1, по сравнению с контрольной индексы гигиены уменьшались,а пародонтальные индексы не увеличивались. Это дает нам право утверждать, что регулярное применение антисептика мультицид в сочетании с ДНКзой1 у пациентов с несъемной ортодонтической аппаратурой уменьшает риск возникновения заболеваний пародонта и твердых тканей зубов на этапах орто-донтического лечения.