- •Депарпамент образования и науки
- •Оглавление
- •Глава 1. Особенности некоторых методов микроскопии
- •Устройство и принцип работы темнопольного конденсора ои-13
- •1.1.1. Условия работы с темнопольным конденсором
- •1.1.2. Порядок работы с темнопольным конденсором:
- •Принцип и порядок работы с фазово-контрастным устройством кф-4
- •1.2.1.Устройство фазово-контрастной приставки кф-4
- •1.2.2. Порядок работы с фазово-контрастным устройством
- •Глава 2. Методы окраски фиксированных препаратов
- •2.1. Подготовка красителей и реактивов для окраски по методу Грама и техника окрашивания
- •2.1.1. Особенности подготовки красителей
- •2.1.2. Техника окраски по методу Грама
- •2.1.3. Дифференциация бактерий по Граму без окрашивания
- •2.2. Выявление кислотоустойчивости и спиртоустойчивости бактерий
- •2.2.1. Окраска по методу Циля-Нильсена
- •2.2.2. Красители и реактивы для окраски кислотоустойчивых бактерий
- •2.3. Методы окраски спор у бактерий
- •2.3.1. Метод Циля — Нильсена в модификации Мюллера
- •3.3.2. Окраска спор по методу Пешкова
- •2.3.3. Окраска спор по методу Виртца в модификации Саватеева
- •2.3.4. Окраска спор по методу Виртца в модификации Шеффелера и Фултона
- •2.3.5. Окраска спор по Битеру
- •2.3.6. Реактивы и красители для окрашивания спор бактерий:
- •2.4. Методы окраски капсул
- •2.5. Методы окраски жгутиков бактерий
- •2.5.1. Окраска жгутиков по методу Леффлера
- •2.5.2. Метод серебрения жгутиков по Морозову
- •2.5.3. Окраска жгутиков по методу Грея
- •2.6. Окраска включений клеток микроорганизмов
- •2.7. Окраска генома бактерий
- •2.7.1. Окраска генома бактерий методом Романовского-Гимза
- •2.7.2. Выявление генома по реакции Фельгена
- •Глава 3. Определение качественного состава микроорганизмов по культуральным, морфологическим и физиолого-биохимическим признакам
- •3.1. Морфологические признаки
- •3.2. Культуральные признаки
- •Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов
- •3.3.1. Тест на наличие каталазы
- •3.3.2. Тест на наличие оксидазы
- •3.3.3. Окислительно-ферментативный (о/f) тест на использование глюкозы (тест Хью — Лейфсона)
- •3.3.4. Тест на наличие уреазы
- •3.3.5. Тест на наличие протеолитической активности (протеиназы)
- •3.3.6. Тест на наличие диастазы (амилазы)
- •3.3.7. Тест на наличие липазы
- •3.3.8. Тест на использование углеводов и органических кислот
- •Тест на редуцирующую способность микроорганизмов
- •Тест на декарбоксилазы и дегидролазы
- •3.3.11. Тест на образование индола и сероводорода
- •3.3.12. Тест на использование фумарата в анаэробных условиях
- •Список использованной литературы
- •Методы исследований при идентификации микроорганизмов Методическое пособие
2.3.1. Метод Циля — Нильсена в модификации Мюллера
До фиксации мазка бактерий на пламени препарат готовят обычным способом. Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат наносят 5%-ный раствор хромовой кислоты. Через 5 — 10 мин ее смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 7 мин. Важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения бумагу снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются.
Далее обесцвечивают цитоплазму клеток (но не споры), обрабатывая препарат 1%-ным раствором соляной или серной кислот в течение 15 — 30 с. При приготовлении препарата спор Bacillus mycoides или Bacillus mesentericus рекомендуется обесцвечивать цитоплазму 16 — 18 с (размеренно считая от 21 до 37 — 40). При превышении этого времени могут обесцветиться и споры. Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим в течение 2-х мин.
Если все операции проделаны правильно, окраска получается контрастной и ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы.
3.3.2. Окраска спор по методу Пешкова
На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до кипения и кипятят 15 — 20 с, держа стекло над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного. Еще раз промывают, подсушивают и далее исследуют препарат с масляной иммерсией объектива. Споры окрашиваются в голубой или синий цвета, цитоплазма — в розовый.
Для исследования спор удобными объектами могут служить Bacillus mesentericus или Bacillus mycoides в возрасте 4 сут.
2.3.3. Окраска спор по методу Виртца в модификации Саватеева
На фиксированный в пламени мазок наносят 3-2 капли дистиллированной воды и накладывают полоску фильтровальной бумаги, окрашенной 5%-ным раствором малахитового зеленого. Препарат нагревают до появления паров (3-4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении воды ее добавляют. После остывания препарата краску с бумагой смывают струей воды и сразу же на мокрую поверхность препарата кладут бумагу, окрашенную сафранином. Через 30-40 сек мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют. При этом свободно лежащие споры окрашены в зеленовато-голубой цвет, споры внутри микробных клеток – темно-зеленые, вегетативные формы – красные.
2.3.4. Окраска спор по методу Виртца в модификации Шеффелера и Фултона
На фиксированный в пламени препарат наносят 5%-ный водный раствор малахитового зеленого и нагревают до появления паров (3-4 раза) в течение 30-60 сек. Препарат промывают водой и докрашивают 0,5 %-ным водным раствором сафранина в течение 30 сек. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, где наблюдают споры зеленого цвета, а вегетативные клетки – красными.