3.3.6. Тест на наличие диастазы (амилазы)

Наличие фермента диастазы (амилазы), расщепляющего крахмал, выявляют при росте культуры на крахмало-аммиачном агаре (КАА), имеющего состав (г/л): растворимый крахмал – 10,0 г; К₂НРО₄ – 1,0; (NH)₄SO₄ - 2,0; MgSO₄ – 1,0; NaCl – 1,0; СаСО₃ – 3,0; агар – 15 г; водопроводная вода или на среде следующего состава (г/л): растворимый крахмал – 2,0; пептон – 10,0; КН₂РО₄ – 5,0; агар -15,0; дистиллированная вода, рН 6,8-7,0. Не разложенный крахмал на этих средах выявляется с помощью раствора Люголя.

Чашки с выросшими культурами заливают раствором Люголя. Зоны вокруг колоний окрасятся либо в красно-бурый цвет (гидролиз дошел до стадии декстринов), либо они останутся бесцветными (гидролиз прошел до стадии сахаров). Наилучшие результаты в опытах по разложению крахмала получаются при работе с растворимым крахмалом. Среда, содержащая крахмал, не должна содержать глюкозы, так как в ее присутствии гидролиз крахмала ингибируется. Положительный пример — Bacillus subtilis, отрицательный — Bacillus macerans, E. сoli.

3.3.7. Тест на наличие липазы

Метод 1. Этот метод используют как для определения всех липаз, так и для определения наличия фосфолипаз, в частности, лецитиназы. Желточно-солевой агар (ЖСА) или элективная среда Чистовича, в чашке Петри засевают штрихом. Можно использовать желточный агар следующего состава (г): пептон — 20; Na₂HPO₄ — 2,5; NaC1 — 1; глюкоза — 1; агар — 12,5; MgSO₄ 0,5%-ный раствор — 1 мл или 0,05 г; дистиллированная вода — 500 мл. Компоненты смешивают, рН смеси доводят до 7,3 — 7,6. Для внутривидовой идентификации иерсиний, выявления фермента у стафилококков рекомендуется использовать ЖСА, где вместо пептона используется казеин панкреатический в таком же количестве и дополнительно добавляется 1 г/л К₂НРО₄. Смесь кипятят до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм и охлаждают до 50-60⁰С. Скорлупу яйца моют, дезинфицируют спиртом (выдерживают 1 час) и дают ей обсохнуть. Яйцо разбивают и отделяют желток от белка. Желток с соблюдением правил асептики переносят в расплавленный агар и перемешивают до получения однородной суспензии (желток можно предварительно смешать с равным объемом стерильного физиологического раствора). Разливают в чашки и оставляют для затвердевания. После инкубации снимают крышку чашки и внимательно просматривают поверхность при косом освещении. Положительный результат — образование маслянистого, блестящего с переливами или перламутрового слоя (опалесценции), «радужного» ореола под колонией и вокруг нее на поверхности arapa.

Положительный пример — Clostridium sporogenes, отрицательный — Clostridium butyricum, Stahpylococcus epidermalis, Stahpylococcus saprophyticus.

Метод 2. Этот метод применяют для эфиров пальмитиновой, стеариновой и олеиновой кислот. Используют агаризованную среду (например, МПА) с добавлением 0,01% СаСl₂. Стерилизуют твин-40 (эфир пальмитиновой кислоты), твин-60 (эфир стеариновой кислоты) или твин-80 (эфир олеиновой кислоты) автоклавированием при 1 атм. Добавляют стерильный твин в расплавленную агаризованную среду при 45 — 50⁰ до конечной концентрации 1%(по объему). Среду встряхивают до полного растворения твина, разливают по чашкам Петри, оставляют до затвердевания и засевают штрихом.

Положительный результат — образование мутного ореола вокруг колоний за счет кальциевых солей жирных кислот — Ps. aeruginosa, отрицательный— Ps. putida.

Метод 3. К 20 мл расплавленного МПА добавляют 1 мл любого растопленного жира, к которому добавлен сернокислый нильский голубой. После тщательного перемешивания агар разливают в чашки Петри и делают посев истощающим штрихом до образования единичных колоний. При положительной реакции вокруг колоний возникает синий ореол.