- •Депарпамент образования и науки
- •Оглавление
- •Глава 1. Особенности некоторых методов микроскопии
- •Устройство и принцип работы темнопольного конденсора ои-13
- •1.1.1. Условия работы с темнопольным конденсором
- •1.1.2. Порядок работы с темнопольным конденсором:
- •Принцип и порядок работы с фазово-контрастным устройством кф-4
- •1.2.1.Устройство фазово-контрастной приставки кф-4
- •1.2.2. Порядок работы с фазово-контрастным устройством
- •Глава 2. Методы окраски фиксированных препаратов
- •2.1. Подготовка красителей и реактивов для окраски по методу Грама и техника окрашивания
- •2.1.1. Особенности подготовки красителей
- •2.1.2. Техника окраски по методу Грама
- •2.1.3. Дифференциация бактерий по Граму без окрашивания
- •2.2. Выявление кислотоустойчивости и спиртоустойчивости бактерий
- •2.2.1. Окраска по методу Циля-Нильсена
- •2.2.2. Красители и реактивы для окраски кислотоустойчивых бактерий
- •2.3. Методы окраски спор у бактерий
- •2.3.1. Метод Циля — Нильсена в модификации Мюллера
- •3.3.2. Окраска спор по методу Пешкова
- •2.3.3. Окраска спор по методу Виртца в модификации Саватеева
- •2.3.4. Окраска спор по методу Виртца в модификации Шеффелера и Фултона
- •2.3.5. Окраска спор по Битеру
- •2.3.6. Реактивы и красители для окрашивания спор бактерий:
- •2.4. Методы окраски капсул
- •2.5. Методы окраски жгутиков бактерий
- •2.5.1. Окраска жгутиков по методу Леффлера
- •2.5.2. Метод серебрения жгутиков по Морозову
- •2.5.3. Окраска жгутиков по методу Грея
- •2.6. Окраска включений клеток микроорганизмов
- •2.7. Окраска генома бактерий
- •2.7.1. Окраска генома бактерий методом Романовского-Гимза
- •2.7.2. Выявление генома по реакции Фельгена
- •Глава 3. Определение качественного состава микроорганизмов по культуральным, морфологическим и физиолого-биохимическим признакам
- •3.1. Морфологические признаки
- •3.2. Культуральные признаки
- •Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов
- •3.3.1. Тест на наличие каталазы
- •3.3.2. Тест на наличие оксидазы
- •3.3.3. Окислительно-ферментативный (о/f) тест на использование глюкозы (тест Хью — Лейфсона)
- •3.3.4. Тест на наличие уреазы
- •3.3.5. Тест на наличие протеолитической активности (протеиназы)
- •3.3.6. Тест на наличие диастазы (амилазы)
- •3.3.7. Тест на наличие липазы
- •3.3.8. Тест на использование углеводов и органических кислот
- •Тест на редуцирующую способность микроорганизмов
- •Тест на декарбоксилазы и дегидролазы
- •3.3.11. Тест на образование индола и сероводорода
- •3.3.12. Тест на использование фумарата в анаэробных условиях
- •Список использованной литературы
- •Методы исследований при идентификации микроорганизмов Методическое пособие
Глава 2. Методы окраски фиксированных препаратов
Исследование бактерий в окрашенном препарате дает возможность не только изучить их морфологию, но и получить представление о некоторых деталях их химического строения. Это достигается применением специальных методов.
Для большинства микроорганизмов царства прокариот о строении клеточной стенки судят после окраски по методу Грама.
2.1. Подготовка красителей и реактивов для окраски по методу Грама и техника окрашивания
2.1.1. Особенности подготовки красителей
1. Карболовый раствор генциана фиолетового или кристаллического фиолетового: в ступке растирают 1 г красителя с 2 г кристаллической карболовый кислоты (фенола) до консистенции кашицы, прибавляя небольшими порциями 10 мл спирта; окончательно разбавляют 100 мл дистиллированной воды. Сливают в емкость из темного стекла и дают отстояться в течение суток. Затем фильтруют и используют для окрашивания по методу Грама.
2. Раствор Люголя в модификации Грама: в ступку помещают 1 г йода кристаллического и 2 г йодистого калия, растирают пестиком, добавляют сначала 1 мл дистиллированной воды, затем еще 5 мл воды. Далее переносят количественно в емкость из темного стекла и доводят общий объем до 300 мл. Хранят не более 30 суток.
3. Фуксин Пфейффера:
а) карболовый фуксин Циля: 1 г основного фуксина растирают в фарфоровой ступке с 5 г кристаллического фенола и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 мл спирта. После того, как краситель хорошо разотрется, при постоянном помешивании прибавляют 100 мл дистиллированной воды. Раствор фильтруют через влажный бумажный фильтр и хранят в емкости из темного стекла длительное время;
б) фуксин Пфейффера (водный раствор карболового фуксина Циля): 1 мл карболового фуксина Циля разводят 9 мл дистиллированной воды и используют для окраски по методу Грама.
4. Спирт 96%-ный.
2.1.2. Техника окраски по методу Грама
Следует помнить, что для окраски по методу Грама используют молодые культуры микроорганизмов: одно-двух суточные; более старые культуры могут дать ложный результат.
на фиксированный препарат (мазок) наности раствор генциана фиолетового или кристаллического фиолотового; выдержать 1-2 мин и краситель слить;
не промывая мазок, нанести на 1-2 мин раствор Люголя (до почернения);
далее препарат обесцветить этиловым спиртом в течение 0,5-1 мин до прекращения отхождения окрашенных струек;
быстро промыть водой;
докрасить препарат водным раствором карболового фуксина Циля в течение 1-2 мин;
промыть водой, убрать излишки воды фильтровальной бумагой, досушить на воздухе и микроскопировать.
Благодаря особенностям строения клеточной стенки прокариот, грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовые цвета, а грамотрицательные – в красно-розовые.
2.1.3. Дифференциация бактерий по Граму без окрашивания
Для разделения бактерий на грамположительные и грамотрицательные можно воспользоваться быстрым и простым методом для дифференциации по Граму без окрашивания.
Клетки культур (1 — 2-суточные) помещают петлей в каплю 3%-ного КОН на предметное стекло, размешивают круговыми движениями и через 5 — 8 с петлю резко поднимают. Суспензия грамотрицательных бактерий становится вязкой и тянется за петлей, образуя мукоидные тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределяются в капле щелочи (как в воде). Реакция считается отрицательной, если образования слизистых тяжей не наблюдается в течение 60 с. Увеличение вязкости вызвано лизисом клеточных стенок грамотрицательных бактерий в растворе щелочи и освобождением ДНК.
Несмотря на высокий процент корреляции между грампринадлежностью известных культур и таковой, определенной вышеописанным методом, бывают исключения. Так, культуры целлюломонад и эрсковий, имеющие строение клеточной стенки, типичное для грамположительных бактерий, проявляют себя в тесте с КОН как грамотрицательные бактерии (образуют тяжи), в то время как грамотрицательные бактерии рода Flavobacterium, наоборот, не образуют вязкой массы подобно грамположительным бактериям. Вероятно, имеются и другие примеры исключений, поэтому метод дифференциации бактерий по Граму без окрашивания следует использовать лишь для предварительной диагностики либо подсчета примерного соотношения колоний грамположительных и грамотрицательных бактерий на чашках.