Современные положения клеточной теории:

1) Клетка - основная единица строения и развития всех живых организмов. Наименьшая единица живого.

2) Клетки всех организмов сходны по своему строению, химическому составу, основным проявлениям жизнедеятельности и обмену веществ.

3) Размножение клеток происходит путем их деления. Каждая новая клетка образуются в результате деления исходной клетки.

4) В сложных многоклеточных организмах клетки специализированны и образуют ткани. Из тканей состоят органы, которые тесно связаны между собой и подчинены нервным и гуморальным механизмам регуляции.

5) Клетки многоклеточных организмов тотипотентны (обладают генетическим потенциалом всех клеток данного организма).

Клетка – ограниченная активной мембраной, упорядоченная структурированная система биополимеров, участвующих в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддерживание и воспроизведение всей системы в целом.

Клетка – открытая система. Обмен с внешней средой потоками веществ, информацией и энергией.

Методы цитологического исследования:

1) Непосредственное наблюдение живых клеток в организме (витальный) или в свежевыделенной ткани (суправитальный).

2) Наблюдение клеток убитых с помощью фиксации, которая сохраняет морфологическую и химическую структуру.

После фиксации любой материал подвергают окрашиванию. Красители – натуральные и синтетические.

Синтетические – кислые и основные. Основные - соли красящих оснований, содержащие аминогруппы, монометиламиногруппы, иминогруппы. Эти группы определяют щелочность красителей. Попадая внутрь клетки, эти группы образуют солевые связи с кислотами, находящимися в структуре клетки, что приводит к их окрашиванию. Кислотные группы клетки - базофильные.

Кислые красители – красящие кислоты или их соли (эозин, пикриновая кислота, азокармин и др.). Кислотные свойства придают нитрогруппы, гидроксильные, карбоксильные группы. Структурные компоненты – ацитофильные или оксифильные.

Широкое распространение получило гистохимическое или цитохимическое окрашивание, которое подразделяется на прямое и косвенное. К прямым методам относят приемы, специфичные для вещества, которые хотят определить. Выявление ДНК – с реактивом Шиффа.

Чтобы обнаружить активность фермента, используют непрямой гистохимический способ или метод ферментативного переваривания. Для этой цели клетки помещают в среду, содержащую субстрат для данной ферментативной реакции и реагенты, связывающие специфически с конечными продуктами реакций.

Краситель Азур связывает и окрашивает цитоплазму, ядро и ядрышко. Предварительная обработка клетки ферментом РНК-азой приводит к тому, что цитоплазма и ядрышко будет окрашиваться слабо, а ядро не изменится в своей окраске. Если же клетку предварительно обработать ДНК-азой, то почти полностью исчезнет окрашивание структур ядра.

На современном этапе особое значение имеют точные способы выявления структур – иммунохимические методы. Это реакции с использованием флуоресцентных антител. Для этого на белок, который хотят определить, получают специфическую сыворотку. В сыворотке содержатся антитела, их соединяют с флуоресцентными красителями. Затем, меченый белок вводят в клетку.

Таким образом был открыт цитоскелет.

Метод фракционирования или дифференциального замещения.

1. Сначала получают чистые клетки, разрушая ткань в гомогенизаторах.

2. Полученную суспензию (гомогенат) подвергают высокоскоростному центрифугированию. Крупные компоненты (ядра или неразрушенные мембранные структуры) оседают при низких скоростях 1-3 тыс.J.

3. При более высоких скоростях (15-30 тыс.) оседают более мелкие макросомы (митохондрии, пластиды, лизосомы, нервные окончания).

4. Более 50 тыс. – микросомы. 15-20% от общей массы. Имеют сложный химический состав. ЭПР, вакуоли.

5. При скорости 150 тыс. – в осадок выпадают рибосомы, вирусы, крупные макромолекулы.

С помощью раствора сахарозы получают более высокую степень разделения. Плотность раствора постепенно увеличивается сверху вниз, образуя градиент плотности. Гомогенат клеток наслаивают поверх сахарозы, затем центрифугируют и органоиды клетки распределяются в зависимости от своей молекулярной массы по высоте градиента, образуя отдельные полосы, которые можно выделить и изучить.