4.2.1.2 Засев носителя поверхностной культурой
В качестве носителя для иммобилизации мицелия гриба данным способом были выбраны губки из нержавеющей стали.
Губки из нержавеющей стали были порезаны на кусочки диаметром приблизительно 1,5 см. Перед использованием носитель был подвержен кипячению в течение 10 мин, а затем трижды промыт дистиллированной водой.
Носитель был подвержены стерилизации в автоклаве при температуре 121 ºС в течение 40 мин.
Иммобилизацию продуцента осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на круговой качалке. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 150 мл питательной среды, 3 агаровых блоков площадью 0,5 см2с мицелием гриба (7 суток роста), что соответствовало 0,0038г сухой массы мицелия, и носитель в количестве 50 см3, что составляло для стальных губок – 6 г. В контрольные колбы вносили 150 мл питательной среды и 3 агаровых блоков площадью 0,5 см2с мицелием гриба (7 суток роста).
Питательная среда имела следующий состав: мука пшеничная – 29,0 г/л; кукурузный экстракт – 6,4 г/л; NH4NO3– 2,0 г/л; КН2РО4– 1,3 г/л; вода водопроводная – до 1 л. Для стимулирования продуцирования лакказы в среду был добавленCuSO4 в концентрации 0,05г/л.pHсреды до стерилизации – 5,6-5,8. Затем колбы инкубировали на круговой качалке с частотой вращения 200 об/мин при температуре 32 ºС в течение 10 суток. Опыт осуществляли в трех повторностях.
В результате проведения экспериментов было установлено, что засев поверхностной культурой также является эффективным способом иммобилизации продуцента на твердых носителях. Эффективность иммобилизации оценивали по отсутствию биомассы гриба в культуральной жидкости Рисунок 5.
Рисунок 5. Иммобилизация мицелия гриба на стальных губках при засеве носителя поверхностной культурой
4.2.2. Иммобилизация мицелия гриба в стационарном состоянии
Иммобилизацию мицелия гриба осуществляли также в стационарном состоянии. При этом в качестве носителей использовали:
дубовые опилки,
костру льна,
сосновые стружки.
Иммобилизацию продуцента осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 мл. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 10 мл питательной среды, 20 мл посевного материала (IIIпассаж, 3 суток роста) и носители в количестве 100 см3, что составляло для дубовых опилок – 4 г, костры льна – 4 г, сосновые стружки – 6 г (удельная площадь поверхности составила 96,8 см2/г ). Активность посевного материала составила 6,65 ЕОА.
Питательная среда имела следующий состав: мука пшеничная – 29,0 г/л; кукурузный экстракт – 6,4 г/л; NH4NO3– 2,0 г/л; КН2РО4– 1,3 г/л; вода водопроводная – до 1 л. Для стимулирования продуцирования лакказы в среду был добавленCuSO4 в концентрации 0,05г/л.pHсреды до стерилизации – 5,6-5,8. Затем колбы инкубировали в термостате при температуре 32 ºС в течение 10 суток. Опыт осуществляли в трех повторностях.
В результате проведения экспериментов по иммобилизации на дубовых опилках и костре льна был установлен поверхностный рост культуры, который выражался сначала в появлении четко различимых отдельных белых пеллет гриба, а затем в полном обрастании поверхности носителя белым воздушным мицелием. При этом носитель слежался в плотный комок Рисунок 6.
а)
б)
Рисунок 6. Иммобилизация мицелия грибной культуры на а) костре льна, б) дубовых опилках
В колбах с сосновыми стружками было отмечено постепенное обрастание носителя. Носитель не слеживался и не слипался, что, в свою очередь, обеспечило свободный доступ воздуха к иммобилизованному мицелию и способствовало более интенсивному проникновению мицелия вглубь структуры носителя Рисунок 7.
Рисунок 7. Иммобилизация мицелия грибной культуры на сосновых стружках
Таким образом, на основании проведенных исследований был сделан вывод о том, что наиболее перспективным носителем для иммобилизации мицелия штамма-деструктора являются древесные стружки, в том числе хвойных пород, которые обеспечивают воздухопроницаемую структуру, необходимую для закрепления мицелия. В качестве способа иммобилизации наиболее пригодным следует считать внесение жидкого посевного материала в стационарную твердофазную культуру.