4. Запитання та завдання для самоперевірки.

1. Яке бродіння має назву «спиртове»?

2. Назвіть збудників молочно - та маслянокислого бродіння.

3. Назвіть оптимальні умови розвитку азотфіксуючих бактерій, дріжджів, збудників молочно - та маслянокислого бродіння.

4. Які побічні продукти утворюються за спиртового бродіння?

5. Яке значення має мікробіологічне аеробне окислення органічних сполук в народному господарстві?

5. Теоретичне обґрунтування

Спиртове бродіння. За визначенням Л. В. Капрельянц, «спиртовим бродінням називається процес розщеплення глюкози мікроорганізмами з утворенням етилового спирту та вуглекислого газу. Збудниками спиртового бродіння є дріжджі (переважно з роду Saccharomyces) та деякі плісеневі гриби, особливо з роду мукорових». Мікроорганізми, що викликають процес спиртового бродіння, за певних температурних та біохімічних умов розкладають вуглеводи поживного середовища з утворенням етилового спирту:

С₆Н₁₂О₁₂ = 2СН₃СН₂ОН + 2СО₂ + х ккал

глюкоза етиловий спирт вугле-

кислота

Процес утворення спирту проходить за анаеробних (без доступу кисню) умов, звичайно за кислої реакції середовища (рН 4,0 - 5,0). Якщо реакцію поживного середовища підтримувати на лужному рівні (рН 8,0), тоді головним продуктом бродіння стає гліцерин. Крім того, за активної життєдіяльності дріжджів утворюються інші продукти, найважливішими з яких є аміловий спирт та янтарна кислота.

Дріжджі можуть розвиватися у широкому діапазоні температур: від 3-5⁰ до 38 - 40⁰ С. Типові представники їх мають здебільшого овальної форми клітини, вегетативне (безстатеве) розмноження звичайно - брунькуванням, іноді - діленням. Брунька утворюється шляхом випинання в певному місці цитоплазми оболонки материнської клітини разом з внутрішньою оболонкою, вона збільшується й, досягаючи розміру материнської клітини, відокремлюється від неї утворюваною пластинкою, перед цим відбувається і ділення ядра.

На практиці розрізняють низові та верхові дріжджі. Верхові використовуються в спиртовій промисловості та хлібопеченні. Їх розвиток проходить за температури 18-30⁰ С, при цьому відмічається бурхливе виділення вуглекислоти та піноутворення. Дріжджові клітини піднімаються на поверхню поживного розчину.

Дріжджі низового бродіння використовують за знижених температурних режимів (4 - 10⁰ С). Низове бродіння іде спокійно і маса дріжджових клітин залишається на дні ємності. Зокрема, такі дріжджі використовують у пивоварінні та виноробстві. Для виробництва пива звичайно застосовують раси Saccharomyces cerevisiae, а в виноробстві - Saccharomyces vini, Saccharomyces ellipsoids та ін..

Дріжджі можуть розвиватися за нейтральної реакції середовища, але активніше бродять при деякому підкисленні. На практиці це попереджує розвиток сторонньої бактеріальної мікрофлори, що погано переносить знижені показники рН - середовища.

Технічне використання спиртового бродіння має велике значення:промислове виробництво якісного вина, спирту, пива та хліба неможливо уявити без чистих культур дріжджів, які забезпечують правильний перебіг процесу та підвищену якість продукції.

Дріжджі також використовують для виготовлення кормового білка з дешевих джерел вуглеводного живлення (наприклад, на відходах целюлозної, текстильної та нафтопереробної промисловості).

Деякі види дріжджів здатні до нагромадження у своїх клітинах великої кількості жирів. Подібні дріжджі, які отримали технічну назву «жирових», запропоновано використовувати для виробництва цінних технічних жирів мікробіологічним шляхом. Дріжджі, які накопичують значну кількість вітамінів, зокрема, вітамінів групи В та біотину (вітамін Н), давно застосовують в біотехнологічних процесах промислового виготовлення цих біологічно активних речовин.

Але не всі дріжджі приносять користь. Серед них є шкідники харчових продуктів та вина, збудники деяких захворювань людини.

Молочнокисле бродіння. За молочнокислого бродіння, що спричиняють специфічні види бактерій, відбувається розпад частини глюкози на дві частини молочної кислоти:

С₆Н₁₂О₆ = 2СН₃СНОНСООН + х ккал

глюкоза молочна кислота

Наразі з основним продуктом бродіння - молочною кислотою - в більшій чи меншій кількості утворюються побічні продукти: оцтова кислота, вуглекислий газ, а іноді - етиловий спирт.

За характером спричиненого бродіння молочнокислі бактерії поділяють на дві головні групи:

1. гомоферментативні, що утворюють з цукрових сполук молочну кислоту за наведеним вище рівнянням та незначну кількість летучих кислот, етилового спирту та ін.;

2. гетероферментативні, що крім молочної кислоти утворюють значну кількість оцтової кислоти, етилового спирту, гліцерину та вуглекислого газу. Перебіг гетероферментативного молочнокислого бродіння може бути розкрито наступним рівнянням:

С₆Н₁₂О₆ → 2СН₃СНОНСООН + СН₃СООН + СН₃СН₂ОН

глюкоза молочна кислота оцтова кислота етиловий спирт

+ СН₂ОНСНОНСН₂ОН + СО₂ ↑

гліцерин вуглекислий газ

Гетероферментні молочнокислі бактерії здатні утворювати незначну кількість ацетилметилкарбінолу та діацетилу, якому притаманний своєрідний приємний аромат, що передається продуктам, де проходить розвиток бактерій.

Слід зазначити, що живлення молочнокислих бактерій доволі різко відрізняється, що використовують для систематики даної групи мікроорганізмів.

Рід Streptococcus містить гомо - та гетероферентативні молочнокислі кокоподібні бактерії. Вони зустрічаються на поверхні рослин та молоці. Типовим представником є Str. lactis, що виявляють у виді коротких ланцюжків та попарно з’єднаних клітин, які мають овальну форму. Живиться окрім моноцукрів лактозою та мальтозою. Оптимальною температурою для розвитку є 30 - 35⁰ С. Показник кислотності, що утворюється молочними стрептококами коливається в межах біля 110-120⁰ Т (⁰Тернера - умовний показник; 1 мл 0,1N NаОН, який пішов на титрування 100 мл молока, відповідає 1⁰ Т).

Інший представник - Str. cremoris (вершковий стрептокок) відрізняється від молочнокислого тим, що його клітини утворюють ланцюжки, а температура розвитку складає 25 - 35⁰ С. Str. cremoris характеризується відсутністю здатності до живлення мальтозою та декстрином, утворює підвищену кількість летучих кислот. Вершковий стрептокок використовують у виробництві кисломолочної продукції, кисловершкового масла та сирів.

Ароматоутворюючі стрептококи Str.citrovorus, Str.paracitrovorus Str.diacetilactis покращують смак та запах молочних продуктів і тому їх застосовують разом з Str. сremoris та Str. lactis у заквасках на промислових виробництвах.

Деякі види, наприклад, такі як Str.termophilus (гетероферментативний стрептокок), розвиваються за підвищеної температури (біля 45⁰ С), живиться цукрозою. Разом з болгарською паличкою (Lactobacterium bulgaricum) вживається для виготовлення південних простокваш. Виграє важливу роль у визріванні сирів з високим другим нагріванням (швейцарський та російський).

Серед молочнокислих бактерій є паличкоподібні форми як подовженої, так і більш короткої форми, що відносяться до роду Lactobacterium. Вони зустрічаються на рослинах, в молочних продуктах та стравохідному тракті людини та тварин. Бактерії роду Lactobacterium нерухомі, спор не утворюють, грампозитивні, мають слабо виражену протеолітичну здатність. Перетворюють вуглеводи, головним чином, до молочної кислоти за оптимальної рН 6,5, але здатні до розвитку навіть при рН 3,8, тоді як стрептококи за такої кислотності середовища припиняють свою діяльність. Крайні показники кислотності молока за умов зростання паличок дещо вище ніж у стрептококів та здатні досягати 300 - 400⁰ Т.

В промислових умовах ряд молочнокислих продуктів готують з закваскою, що являє собою симбіотичні комплекси мікроорганізмів. Зокрема, для виготовлення кефіру в молоко додають так звані зернини кефіру. Ці зернини подібні до мініатюрних голівок цвітної капусти. Вони містять Lactobacillus casei стрептококи, дріжджі Saccharomyces kefir, що зброджують лактозу. Продуктами бродіння є молочна кислота та спирт.

Квашення овочів та силосування кормів також зводиться, в основному, до їхнього молочнокислого бродіння.

До нетипових молочнокислих бактерій відносять групу кишкової палички Escherichia coli. Ці грамнегативні мілкі палички зустрічаються у стравоході людини та тварин, у водоймах та інших об’єктах, тому даний мікроорганізм є показником забруднення води, продуктів харчування та ін..

Маслянокисле бродіння. Трансформація вуглеводів з утворенням масляної кислоти виконується облігатними анаеробними спороутворюючими паличками, які відносяться до роду Clostridium, що може бути відображено наступним узагальненим рівнянням:

С₆Н₁₂О₆ = 2СН₃СН₂СН₂СООН + СО₂ ↑ + Н₂ ↑

глюкоза молочна кислота вуглекислий гідроген

газ

Типовим представником маслянокислих бактерій, що виконують молочнокисле бродіння є Clostridium butyricum, крупна паличка розміром до 1 - 2 × 10мк . В молодому стані вона є рухливою, але на пізніх стадіях розвитку втрачає джгутики, набуває веретеноподібної форми та нагромаджує всередині клітини запасну речовину - полісахарид гранулезу. При утворенні спори клітина набуває форми барабанної палички (рис.1 )

Рис. 1 Представник маслянокислих бактерійClostridium butyricum

Серед маслянокислих бактерій є як мезо - , так і термофільні форми з сапрофітним (Clostridium pasterianum, Cl.butyricum, Cl.felsineum) або паразитичним (Clostridium botulinum, Cl.tetani, Cl.perfringens) способом живлення.

У ряді випадків маслянокисле бродіння є небажаним, наприклад, його протікання у кормах зумовлює псування зеленої маси. Білкова частина кормів розкладається, а накопичена масляна кислота надає йому неприємного запаху.

Разом з цим, для деяких промислових цілей потребується масляна кислота, яку отримують в процесі зброджування спеціально підготовленої маси чистими культурами молочнокислих бактерій та виділяють хімічними методами очищення.

Вільноживучі та симбіотичні азотфіксатори. Запаси газоподібного азоту в атмосфері практично невичерпні. Над кожним кілометром земної поверхні у повітрі знаходиться біля 8 млн. т азоту. Цього запасу вистачило б на отримання урожаю в 30 ц/га впродовж 80 млн. років. Однак, рослини для живлення потребують мінеральні сполуки азоту, бо засвоювати молекулярний азот не здатні.

Асиміляція атмосферного азоту мікроорганізмами має велике значення в загальному балансі азоту в ґрунті. Особлива роль у фіксації азоту в ґрунті належить бактеріям, які засвоюють елементарний азот атмосфери і таким чином збагачують ґрунт зв'язаним азотом.

Бульбочкові бактерії утворюють бульби на коренях більш ніж 1300 видів бобових рослин. Втілившись у тканину кореня, ці бактерії поширюються зазвичай у вигляді інфекційних ниток - колоній розмножених клітин бактерій.

У зрілої бульбочкової тканини бактеріальні клітини перетворюються на бактероїди. На відміну від бактеріальної клітини, що має форму палички, бактероїди - грушоподібні, сферичні або гіллясті утворення в три-чотири рази більш великих розмірів. Зона бульбашок з клітинами як бактеріальної, так і бактероїдной форми отримала назву бактероїдной.

Форма і розміри бульбочок різних бобових рослин неоднакові (рис. 2). У конюшини вони довгасті і дрібні, у гороху і вики - округлі і великі. У квасолі та сої діаметр бульбочок досягає 1 см, а у люпину вони іноді досягають величини волоського горіха. Руйнування бульбочок супроводжується деградацією елементів рослинної клітини і лізисом частини бактероїдів, тоді як інша їх частина утворює дрібні коккоподібні клітини - своєрідні артроспори, що виконують функцію розмноження.

Рис. 2. Форма бульбочок у бобових рослин: а - чини; б - конюшини; в - гороху і вики; г - люцерни; д - люпину.

При вивченні бульбочкових бактерій в оптичному мікроскопі артроспори не видно. Їх можна виявити лише при великому збільшенні під електронним мікроскопом.

На живильних середовищах клітини ризобій - рухливі неспороносні, грамнегативні палички. Серед них зустрічаються дрібні вуглуваті і коккоподібні клітини. У старих культурах клітини більші, паличкоподібні, нерухомі, зрідка зустрічаються Т-образні бактероідной форми. За швидкістю зростання бульбочкові бактерії ділять: на повільноростучі, наприклад у люпину, сої; швидкоростучі - у гороху, конюшини та ін

Будова бульбочок бобових вивчають на зрізах, які роблять гострою ботанічною бритвою або готують на мікротомі. Тонкий зріз, поздовжній або поперечний, поміщають на предметне скло і оглядають в роздавленій краплі при різних збільшеннях. У сухий системі переглядають структуру бульбочок, виявляють бактероідную тканину, а потім, якщо зріз досить тонкий, препарат досліджують з імерсійною системою, де добре проглядається бактероідна зона бульбочок.

Існують організми, що спроможні живитися молекулярними формами азоту та будувати з нього всі різноманітні органічні складові своєї клітини. Такі азотфіксуючі організми вільно живуть у ґрунті або знаходяться у симбіотичних відносинах з вищими рослинами.

Чисту культуру азотфіксуючого мікроорганізму вдалося вперше виділити С. М. Виноградському (1893). Це була анаеробна спороутворююча паличка, що отримала назву Сlostridium pasteurianum. Декілька пізніше голландський мікробіолог М. Бейєринк (1901) відкрив Azotobacter - аеробну бактерію ґрунту, що теж здатна до засвоєння молекулярного азоту, а ще в 1888 році ним була виділена чиста культура азотфіксуючих клубенькових бактерій, що мали симбіотичні відносини з вищими рослинами.

Клітини анаеробного вільноживучого мікроорганізму Сlostridium pasteurianum, що засвоює молекулярний азот повітря, представляють собою палички довжиною 1,5 - 8,0 мк та шириною 0,8 - 1,3 мк. Вони мають джгутики та утворюють спори. При цьому клітини потовщуються посередині або в кінці, частіше зустрічається клостридіальна форма спороутворення (рис 3 ).

Рис. 3. Спори анаеробного вільноживучого мікроорганізму Сlostridium pasteurianum

Сlostridium pasteurianum маловимогливий до реакції середовища, здатен до розвитку як у кислих (рН 4,5 - 5,5), так і в лужних ґрунтах (рН 8,0 - 9,0). Спори дуже витривалі, витримують нагрівання до 96⁰ С впродовж декількох хвилин.

Найчастіше зустрічається в ґрунтах аеробний фіксатор повітряного азоту Azotobacter chroococcum (рис.4), що має молоді рухливі клітини паличкоподібної форми (розміром 2-3 × 4-6 мк), які з часом перетворюються на крупні коки діаметром до 4 мк. Кокоподібні клітини звичайно вкриваються капсулою та містять різні включення (жири, крохмаль і т.п.). За зміни форми джгутики звичайно втрачаються. Інколи кокоподібні клітини вкриваються товстою оболонкою та перетворюються в цисти.

Рис.4. Аеробний фіксатор повітряного азоту Azotobacter chroococcum

Azotobacter chroococcum виділяє речовини, що пригнічують розвиток патогенних грибів родів Alternaria, Fusarium, Rhizoctonia, Bipolaris, які є збудниками цілого ряду захворювань рослин. Крім того, в залежності від кількості азоту в ґрунті може перелаштовувати своє відношення до цього елемента: в умовах його нестачі – активно фіксує з повітря і таким чином покращує азотне живлення рослин. При достатньому забезпеченні рослин цим елементом, азотобактер зменшує втрати його з ґрунту, а при значній кількості – перешкоджає від накопичення нітратів у продукції. Крім азоту, сприяє кращому засвоєнню рослиною важкодоступних форм фосфору, калію та мікроелементів з ґрунту.

Отже, крім підвищення урожаю та родючості ґрунту азотобактер покращує якість продукції. В урожаї збільшується вміст білка, вітамінів, крохмалю, проте зменшується кількість нітратів.