Література

1. Боєчко Ф.Ф. Біологічна хімія. -К.: Вища школа, 1995.

2. Стеценко О.В., Виноградова Г.П. Біоорганічна хімія.-К.: Вища школа, 1992.

3. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990.

4. Кучеренко Н.Е. и др. Биохимия.- К.: Вища школа, 1988.

5.Филиппович Ю.Б.Основы біохімии.-М.:Высш.шк.,1985.-503с.

6.Хорст А.Молекулярные основы патогенеза болезней .-М.:Медицына,1982.-456с.

7.Савицкий И.В.Биологическая химия.-К.:Вища шк.. Главное изд-во,1982.-472с.

Лабораторна робота № 8 Кількісне визначення аскорбінової кислоти в різних овочах і фруктах

Мета:__

_- сформувати вміння виділяти вітамін С з рослинного матеріалу і кількісно його визначати титрометричним методом;

• дати порівняльну характеристику вмісту аскорбінової кислоти у різних рослинах.

Знання і вміння, які повинні отримати студенти:

• знання способів екстракції вітаміну С з біологічного матеріалу;

• знання про кількісний вміст аскорбінової кислоти в різних рос­линах, роль вітаміну С у процесах метаболізму;

• уміння вилучати вітамін С з рослин і кількісно визначати титру­ванням робочим розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу.

Хімічна будова та роль у процесах метаболізму вітаміну С

Вітамін С - похідний Ь-гулонової кислоти: 2,3-ендіол-1,4-лакто-ну-Ь-гулонової кислоти. Цю речовину виділив із кори наднир-ників, а пізніше з соку апельсинів і капусти угорський біохімік Сент-Дьордьї. При С-авітамінозі виникає захворювання цинга, латинською - «скорбут». Тому вітамін, що запобігає цьому захво­рюванню, було названо антискорбутним, або аскорбіновою кисло­тою. На цингу хворіють лише примати і морські свинки. Інші види вміють синтезувати аскорбінову кислоту. При авітамінозі спостерігається кровоточивість ясен, слизових оболонок, м'язів, розхитуються і випадають зуби, з'являються підшкірні геморагії.

Аскорбінова кислота є дуже сильним відновником і одним з найкращих природних антиоксидантів. При окисненні аскорбі­нової кислоти утворюється дегідроаскорбінова кислота. У тварин і людини найбільше аскорбінової кислоти міститься в тканинах наднирників. Аскорбінова кислота надходить у багато клітин у вигляді дегідроаскорбінової кислоти. У клітинах вона швидко підновлюється, наприклад, цистеїном чи глутатіоном. При окисненні аскорбінова кислота перетворюється в дегідроаскорбі-нову, дегідроаскорбінова - у дикетогулонову, а при розпаді дикето-гулонової утворюється щавлева кислота. Частина дикетогулоно-вої кислоти декарбоксилюється з утворенням ксилози, яка вико­ристовується для біосинтезу рибози, дезоксирибози або глюкози.

Вітамін С бере участь практично у всіх окисно-відновних процесах в організмі. Він є донором і акцептором протонів і електронів. Аскорбінова кислота використовується у відновлен­ні дисульфідних зв'язків у молекулах ферментів. При С-авіта-мінозі порушується перехід проколагену в колаген, що призво­дить до кровотеч. Порушується біосинтез колагену в кістковій тканині і гіалуроновій кислоті. Виникають типові цинготні змі­ни скелета. Уповільнюється регенерація всіх тканин, біосинтез гормонів наднирників, дентину, процеси зсідання крові, гальму­ється активність багатьох ферментів.

За нормами концентрація аскорбінової кислоти в плазмі людини складає 0,7-1,2 мг/100 см³. У дорослих людей норма сумарного вмісту аскорбату -1,5 г. Він підтримується при вжи­ванні ЗО мг аскорбату щоденно.

Свіжі фрукти та овочі є важливими джерелами аскорбінової кислоти. Кип'ятіння, консервування можуть зруйнувати части­ну вітаміну С. Вміст аскорбінової кислоти в м'ясних продуктах дуже низький, а при варінні м'яса вітамін руйнується.

Тривале безконтрольне вживання аскорбінової кислоти, про­дукти метаболізму якої пригнічують функцію острівців Лангер-ганса, може призвести до виникнення цукрового діабету, уражен­ня нирок, артеріальної гіпертензії. Хоча аскорбінова кислота і має антиоксидантні властивості, за наявності йонів Ре³⁺ вона сприяє утворенню вільних радикалів, які згубно діють на організм.

Важлива роль аскорбінової кислоти і "в життєдіяльності рос­лин. Рівень цього вітаміну в рослинах може бути характеристи­кою інтенсивності обмінних процесів на різних етапах розвит­ку. Однією з функцій аскорбінової кислоти в рослинах є захист фотохімічного апарата фотосинтезу, який відповідає за перетво­рення світлової енергії в хімічну, від деструктивної дії світла.

Аскорбінова кислота захищає зелений пігмент від окиснен-ня, спільно з вітаміном К бере участь у складних синтетичних реакціях, які відбуваються при фотосинтезі. Доведено, що дегід­роаскорбінова кислота контролює мітотичну активність і тим самим впливає на розвиток рослин.

Аскорбінова кислота міститься в кожній клітині зелених рослин і підтримує певною мірою відновні властивості клітин (хлоропластів).

Збільшення вмісту вітаміну С характерно для рослин із під­вищеною стійкістю до низьких температур. Накопичення аскор­бінової кислоти в рослинах значно підвищується зі зниженням температури в період вегетації. Сприятлива дія аскорбінової кислоти на збільшення холодостійкості рослин полягає в тому, що при зниженні зовнішньої температури посилюються реакції, у яких бере участь вітамін С.

Аскорбінова кислота різко підвищує дихання рослин, знижу­ючи дихальний коефіцієнт. Вважається, що вона необхідна для синтезу білків, що беруть участь у процесі дихання. У процесі дихання відбувається окиснення вітаміну С.

Ферментативне окиснення аскорбінової кислоти може відбу­ватися прямим шляхом при участі специфічної аскорбатоксида-зи, а також непрямим - через посередництво хінонів та інших окиснених продуктів, які утворюються в результаті діяльності різних оксидаз. Окиснюючись, аскорбінова кислота перетворю­ється в дегідроформу, яка виконує роль акцептора Гідрогену.

Як правило, вміст аскорбінової кислоти у квітах значний, причому, чим інтенсивніше забарвлення квітки, тим більше у ії пелюстках вітаміну С.

У насінні рослин аскорбінова кислота відсутня, але при про­ростанні, коли починається інтенсивний обмін речовин, утворен­ня цього вітаміну швидко збільшується.

Найбільш активно відбувається утворення аскорбінової кис­лоти в рослинах, які ростуть на відкритих слабкозатемнених місцях і на помірно зволожених ґрунтах. Верхні частини рос­лин містять більше аскорбінової кислоти і менше дегідроаскор-бінової, ніж нижні, - пропорційно освітленості. Рівень аскорбі­нової кислоти в рослинах гірських районів вищий, ніж у росли­нах низин.

У більшості рослин великий вміст вітаміну С спостерігаєть­ся в недозрілих плодах і в міру їх дозрівання зменшується, але в дозрілих плодах шипшини відмічається максимум накопичен­ня цього вітаміну.

Хід роботи. Нарізають дрібними шматочками рос­линний матеріал (картопля, цибуля, капуста, яблука, груші та інше). Непридатним для визначення аскорбінової кислоти за цим методом є матеріал, гомогенат якого має забарвлення (мор­ква, буряк, пелюстки квітів та інше).

У фарфорову ступку переносять 10 грамів матеріалу і розти­рають з невеликою кількістю кварцового піску, додаючи невеликими порціями розчин хлоридної кислоти (со = 5%) до одержання рідкої кашки (розчину кислоти не повинно бути біль­ше 100 см³). Гомогенат кількісно переносять у мірну колбу на 100 см³. Ступку і пестик ретельно обмивають тим же розчином хлоридної кислоти і переносять його у мірну колбу. Вміст кол­би доводять дистильованою водою до риски, перемішують пере­вертанням колби догори дном і фільтрують або центрифугу­ють. Не треба переносити із ступки в колбу пісок, який викорис­товували для одержання гомогенату.

Одержаний екстракт має бути зовсім прозорим, його інколи треба фільтрувати декілька разів.

Для визначення вмісту аскорбінової кислоти у дві конічні колбочки на 50 см³ беруть піпеткою по 10 см³ одержаного екс­тракту з рослинного матеріалу. Вміст колб титрують з мікробю-ретки розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу. За наявності в екстракті вітаміну С розчин знебарвлюється, а при подальшому додаванні робочого розчину з'являється блідо-рожеве забарвлен­ня. Робочий розчин 2,6-дихлорфеноліндофенолу забарвлений у синій колір. При взаємодії з аскорбіновою кислотою відбуваєть­ся відновлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу, а відновлена форма безбарвна. Коли вся аскорбінова кислота буде окиснена реаген­том, подальше його відновлення не відбуватиметься і невеликий надлишок реагенту дасть блідо-рожеве забарвлення, а не синє, бо в кислому середовищі 2,6-дихлорфеноліндофенол має червоне забарвлення.

В одній із проб руйнують вітамін С кип'ятінням за наявно­сті декількох крапель гідроген пероксиду і проводять усі описа­ні операції. У пробі, де вітамін С був зруйнований, при додаванні декількох крапель робочого розчину з'являється рожеве забарв­лення. За середньою величиною титрування розраховують вміст вітаміну С:

,

де С - вміст аскорбінової кислоти, мг%; Т - титр розчину 2,6-дихлор­феноліндофенолу за аскорбіновою кислотою; У - загальний об'єм вітамінного екстракту, см³; а - маса досліджуваного матеріалу, г; У₁ - затрачений об'єм реагенту при титруванні, см³; - взята для титрування аліквота із загального об'єму екстракту, см³.

У результаті знаходять вміст вітаміну С в міліграмах на 100 г досліджуваного матеріалу.

За даною методикою визначається лише відновлена форма аскорбінової кислоти.

Визначення mumpy розчину 2,6-дихлорфеноліндофенолу. Титр розчину 2,6-дихлорфеноліндофенолу (C(l/z) = 0,001 моль/дм³) за аскорбіновою кислотою визначають у день роботи. Беруть 2 см³ розчину аскорбінової кислоти (со = 0,1 %) і вносять у 50 см³ розчину НР0₃ (со = 2%), перемішують. Беруть 5 см³ одержаного розчину і титрують розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу до появи рожевого забарвлення. Відмічають затрачений на титру­вання об'єм реагенту. Такий же об'єм розчину аскорбінової кислоти титрують з іншої бюретки титрованим розчином ка­лій йодату (C(l/z) = 0,001 моль/дм³). До розчину аскорбінової кислоти перед титруванням додають декілька кристалів (не біль­ше 0,1 г) калій йодиду і 5 крапель розчину крохмалю (со = 1%). Обережно титрують до появи ледь помітного синього забарвлен­ня і відмічають затрачений на титрування об'єм калій йодату. Оскільки в першому і другому випадку були відтитровані одна­кові об'єми аскорбінової кислоти, кількості затрачених калій йодату та 2,6-дихлорфеноліндофенолу еквівалентні. Через те що 1 см³ розчину калій йодату (C(l/z) = = 0,001 моль/дм³) еквівале­нтний 0,088 мг аскорбінової кислоти, титр розчину 2,6-дихлор­феноліндофенолу за аскорбіновою кислотою становитиме: