Занятие 3.

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Регуляция биосинтеза биологически активных веществ в условиях промышленного производства.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:Изучение теоретических основ процесса регуляции биосинтеза биологически активных веществ в условиях промышленного производства. Рассмотрение основных факторов, влияющих на ход процессов биосинтеза биологически активных веществ. Аппаратурное оформление процессов биосинтеза в условиях промышленного производства.

Вопросы, выносимые на семинар:

1. Перечислите факторы, влияющие на протекание процесса биосинтеза биологически активных веществ.

2. Объясните влияние на протекание процесса биосинтеза биологически активных веществ микробиологического фактора.

3. Перечислите условия необходимые для выращивания любой микробной культуры.

4. Введите понятие коэффициента выхода микробной биомассы.

5. Введите понятие коэффициента конверсии.

6. Приведите схему и объясните направление потоков углерода и энергии при гетеротрофном росте микробов и образовании продукта.

7. Охарактеризуйте влияние сродства к субстрату на рост микроорганизмов.

8. Поясните влияние на протекание процесса биосинтеза стабильности культуры.

9. Перечислите факторы, оказывающие влияние на процесс повреждения клеток.

10. Охарактеризуйте особенности создания высокоактивных штаммов-продуцентов.

11. Охарактеризуйте влияние на протекание процесса биосинтеза биологически активных веществ технологических факторов.

12. Назовите факторы, влияющие на экономичность процесса биосинтеза биологически активных веществ.

13. Введите понятие промышленного биореактора и перечислите основные виды биореакторов.

14. Поясните сущность хемостатного и турбидостатного режимов культивирования. Охарактеризуйте аппаратурное оформление процессов.

15. Приведите уравнение материального баланса для биореактора, работающего в проточном режиме с идеальным перемешиванием без рецикла.

16. Приведите уравнения материального баланса для проточного реактора непрерывного действия с полным перемешиванием и с рециклом.

17. Перечислите основные системы любого биореактора и поясните особенности их разработки.

18. Поясните особенности масштабирования биореакторов и охарактеризуйте, какие проблемы сопровождают этот процесс.

Задание 1: Изучить учебный материал.

Учебный материал.

На протекание процессов биосинтеза биологически активных веществ в условиях производства оказывает влияние ряд факторов, которые условно можно разделить на две большие группы – микробиологические и технологические факторы. Для того, чтобы рассмотреть особенности регуляции процессов биосинтеза биологически активных веществ необходимо более подробно остановиться на рассмотрении влияния вышеперечисленных факторов на данный процесс.

Микробиологические факторы.

Основа современного биотехнологического производства – микробиологический синтез, т.е. синтез различных веществ с помощью микроорганизмов. Объекты растительного и животного происхождения еще не нашли широкого применения вследствие их высокой требовательности к условиям культивирования, в значительной степени удорожающей производство.

Независимо от природы объекта, начальным этапом биотехнологической разработки является получение чистых культур клеток и тканей. Дальнейшие этапы манипуляции с этими культурами характеризуются многообразием подходов, основанных на классических методах микробиологии. В этом смысле культуры клеток и тканей растений и животных уподобляются культурам микроорганизмов. Велик и разнообразен мир микробов. Их общее свойство – малые размеры, вследствие чего они видны лишь под микроскопом. При столь большом разнообразии микроорганизмов как провести правильный подбор тех форм, продукция которых нас интересует?

Для решений подобных задач проводится выделение микроорганизмов. Отбираются пробы из мест, где обитание того или иного продуцента наиболее вероятно. Образцы проб вносят в жидкие питательные среды специального состава. Эти среды называют элективными: в них путем варьирования различных факторов создаются избирательные условия для преимущественного развития, интересующего нас продуцента. К этим факторам относятся источники энергии, углерода, азота, значения рН, температура, осмотическое давление и т.д.

Так, для накопления продуцента холестериноксидазы используют среды с холестерином в качестве единственного источника углерода.

Таким образом, получают накопительные культуры микроорганизмов. Следующий этап – выделение чистых культур. Для этого используют плотные питательные среды, на которые засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии, при их последующем пересеве получают чистые культуры продуцента, состоящие из популяций клеток одного вида.

Существует и другой путь подбора микроорганизмов – из имеющихся коллекций микроорганизмов. При этом руководствуются опытом, накопленным в результате изучения физиологии и биохимии различных групп микроорганизмов: продуценты антибиотиков чаще всего находят среди актиномицетов, внеклеточное выделение гидролитических ферментов характерно для грамположительных бактерий, типичные продуценты этанола – дрожжи и т.д.

Способность синтезировать целевой продукт является главным критерием при отборе продуцентов, но микробиологическая промышленность предъявляет к продуцентам еще целый ряд других требований, важных с точки зрения технологии производства.

Микроорганизмы должны:

1. обладать высокой скоростью роста;

2. использовать для жизнедеятельности дешевые не пищевые субстраты;

3. быть устойчивыми к заражению посторонней микрофлорой.

Все это позволяет значительно снизить затраты на производство целевого продукта.

Одноклеточные организмы, как правило, характеризуются более высокими скоростями синтетических процессов, чем высшие формы живого. Так, корова массой 500 кг в течение одних суток синтезирует около 0,5 кг белка. Такое же количество белка за одни сутки можно получить с помощью 5 г дрожжей.

Столь высокие скорости роста характерны не для всех микроорганизмов. Существуют так называемые олиготрофные микроорганизмы, растущие крайне медленно. Они мало изучены, но представляют значительный интерес как возможные продуценты различных веществ. Поэтому исследование факторов, регулирующих рост культур, оптимизация условий выращивания этих продуцентов имеют большое теоретическое и практическое значение в биотехнологии.

Особый интерес как объекты биотехнологических разработок представляют фотосинтезирующие микроорганизмы. Они используют в своей жизнедеятельности энергию света, синтезируют разнообразные вещества клеток в результате восстановления углекислоты, сопряженного с окислением воды (цианобактерии и эукариоты), способны к усвоению атмосферного азота (прокариоты), т.е. обходятся самым дешевыми источниками энергии, углерода и азота. Преимущества фотосинтетиков очевидны перед традиционными в настоящее время объектами биотехнологии – микроорганизмами, энергетические и конструктивные потребности которых обеспечиваются органическими соединениями. Фототрофные микроорганизмы перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и различных биопрепаратов. Большое будущее ожидает фотосинтетиков на пути генетической инженерии в связи с созданием новых технологий микробиологического производства на основе биоконверсии солнечной энергии.

Выгодным объектом для биотехнологии являются термофильные организмы. Они оптимально растут при высоких температурах (60 – 80 °С, а отдельные представители до 110 °С и выше, в подводных выбросах сверхгорячих вод на больших океанических глубинах найдены микроорганизмы, способные развиваться под давлением при температурах до 300 °С), что затрудняет развитие посторонней микрофлоры. Среди термофилов обнаружены ценные продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Применение термофилов позволяет снизить затраты на стерилизацию промышленного оборудования. Кроме того, скорость роста и метаболическая активность у этих организмов в 1,5 – 2 раза выше, чем у мезофилов (температурный оптимум развития составляет 25 – 40 °С). Ферменты, синтезируемые термофилами, в частности протеазы, имеют высокую устойчивость к нагреванию, действию окислителей, детергентов, органических растворителей и другим неблагоприятным условиям. В то же время они малоактивны при нормальных температурах. Так, активность протеазы при 20 °С почти в 100 раз ниже, чем при 75 °С. Это свойство имеет прикладное значение, например, в пищевой промышленности. И наконец, еще одно преимущество термофилов связано с затратами на охлаждение биореакторов. Поскольку реактор для культивирования термофильных микроорганизмов действует при температурах, значительно превышающих температуру окружающей среды, высокий перепад температур способствует быстрой теплоотдаче. Это позволяет применять биореакторы без громоздких теплообменных устройств и тем самым упростить их конструкцию, облегчая тем самым аэрацию, перемешивание и пеногашение.

Таким образом, в любом микробиологическом процессе ключевую роль играет культура используемых микроорганизмов. В промышленной микробиологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, бактерии и водоросли в виде чистых или смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдают смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников, но эти культуры были, затем улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза (для производства вторичных метаболитов).

Для выращивания любой культуры необходимы:

1. жизнеспособный посевной материал;

2. источники энергии и углерода;

3. питательные вещества для синтеза биомассы;

4. отсутствие ингибиторов роста;

5. соответствующие физико-химические условия.

Если эти требования выполнены, то скорость роста (увеличения биомассы) одноклеточных микроорганизмов с бинарным делением, размножающихся в условиях хорошо перемешиваемой периодической культуры, будет пропорциональна концентрации микробной биомассы, т.е.

dх/dt = mх, (1), где

dх/dτ – скорость роста;

μ – коэффициент пропорциональности (удельная скорость роста);

х – концентрация биомассы.

При любой количественной оценке роста микроорганизма или синтеза конечного продукта необходимо связать образование микробной биомассы и продуктов с расходованием субстратов и питательных веществ. Для описания соотношения между ростом микроорганизма и потреблением углеродного энергетического субстрата были введены понятия урожая бактериальной культуры и выхода биомассы.

В математической форме коэффициент выхода микробной биомассы Υx/s:

Υx/s= - dx/ds, где

ds – бесконечно малое уменьшение концентрации субстрата, соответствующее бесконечно малому увеличению концентрации микробной биомассы dx..

Знак «-» в формуле указывает, что знаки изменения x и s противоположны.

Так как при постоянных условиях роста, коэффициент выхода остается постоянным и если ввести обозначения: x_о и s_о – концентрации субстрата и биомассы в момент времени t_о, а x и s – в момент t, то получим следующее выражение для расчета коэффициента выхода микробной биомассы;

(x- x_о)= Υx/s (s_о - s) (2)

Υx/s – переменная величина, зависящая от условий культивирования.

Понятие коэффициента выхода можно распространить на все разнообразие питательных веществ, используемых растущими микроорганизмами и все получающиеся продукты.

При оценке относительной эффективности биохимических путей, лежащих в основе роста и метаболизма микроорганизмов, широко применяют понятие молярного урожая биомассы, позволяющее учесть число электронов, поступающих от субстратов, а также суммарное количество потребляемой энергии.

Когда микроорганизмы растут на хорошо растворимых субстратах, коэффициент выхода и коэффициент конверсии совпадают, но при росте на плохо растворимых и несмешивающихся субстратах они могут заметно различаться.

Коэффициент конверсии можно определить как количество микробной биомассы, образующейся на единицу массы субстрата.

Для описания процесса образования какого-либо продукта микроорганизмов, растущих на данном субстрате можно воспользоваться уравнением:

Yp/s = - dp/ds.

Или данное выражение можно записать иначе;

(p - p_о) = Yp/s(s_о - s), где

Yp/s - коэффициент выхода продукта;

dp – бесконечно малое увеличение концентрации продукта;

p - p_о - исходная концентрация продукта и концентрация его в момент времени t.