Занятие 2.
ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Скрининг продуцентов биологически активных веществ из почвенных микроорганизмов. Определение антимикробной активности антибиотиков.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Закрепление теоретического материала по вопросам лабораторного и промышленного культивирования микроорганизмов с целью получения биологически активных веществ (антибиотиков). Изучение основных методов определения антимикробной активности антибиотиков.
Вопросы, выносимые на семинар:
Введите понятие вторичных метаболитов.
Введите понятие процесса селекции, его цели и задачи.
Перечислите основные методы селекции.
Перечислите и охарактеризуйте виды отбора и гибридизации.
Охарактеризуйте сущность явления мутагенеза.
Перечислите и поясните влияние различных видов мутагенов на культуры микроорганизмов.
Приведите понятие и охарактеризуйте сущность метода скрининга штаммов. Перечислите достоинства и недостатки метода скрининга.
Объясните, в чем заключается сущность метода биологических проб, использующегося при оценке образования антибиотиков и метаболитов.
Охарактеризуйте возможности аппаратурного оформления при реализации метода скрининга.
Поясните, в чем заключается особенность метода обогащения, используемого при культивировании микроорганизмов.
Охарактеризуйте сущность метода прямого отбора проб.
Объясните, в чем заключаются особенности получения промышленных штаммов.
Рассмотрите особенности культивирования микроорганизмов в условиях промышленного производства.
Приведите характеристику и укажите основные сферы применения антибиотиков.
Перечислите и поясните основные свойства антибиотиков.
Укажите основные источники получения антибиотиков.
Охарактеризуйте, какие условия необходимо создать для осуществления синтеза антибиотиков.
Перечислите и охарактеризуйте основные стадии промышленного получения антибиотиков.
Приведите понятие «антибиотикограмма».
Перечислите методы определения антимикробной активности антибиотиков.
Охарактеризуйте сущность дискодиффузионного метода определения антимикробной активности антибиотиков.
Охарактеризуйте сущность метода последовательных (серийных) разведений.
Приведите понятие минимальной подавляющей концентрации.
Охарактеризуйте сущность метода дорожек по Флемингу.
Рассмотрите основные виды устойчивости микроорганизмов к действию антибиотиков.
Задание 1: Изучить учебный материал.
Учебный материал. Скрининг продуцентов биологически активных веществ.
Вторичные метаболиты.
Вторичные метаболиты (идиолиты) – низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре. Они производятся ограниченным числом таксономических групп и часто представляют собой смесь близкородственных соединений, относящихся к одной и той же химической группе. К вторичным метаболитам относятся: антибиотики, алкалоиды, гормоны роста, токсины и т.п.
Микроорганизмы, производящие вторичные метаболиты, вначале проходят стадию быстрого роста, тропофазу, во время которой синтез вторичных веществ незначителен. По мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких компонентов питательной среды в культуральной среде, микроорганизмы переходят в идиофазу; именно в этот период синтезируются идиолиты.
В случае антибиотиков большинство микроорганизмов в процессе тропофазы чувствительно к собственным антибиотикам, однако во время идиофазы они становятся к ним устойчивыми. Чтобы уберечь микроорганизмы, продуцирующие антибиотики, от самоуничтожения, важно быстро достичь идиофазы и затем культивировать микроорганизмы в этой фазе.
Краткая характеристика класса антибиотиков.
Антибиотики – это вещества, продуцируемые микроорганизмами или получаемые из других природных источников, обладающие антибактериальным действием. Они вмешиваются в обмен белков, нуклеиновых кислот и в энергетические процессы поражения организмов и клеток, избирательно воздействуя на определенные межмолекулярные механизмы. Химическая природа антибиотиков разнообразна и сложна, среди них есть пептиды, полиеновые соединения, полициклические вещества и т.п.
Антибиотики по направлению действия классифицируются на следующие группы:
антибактериальные;
противогрибковые;
антипротозойные;
противовирусные;
противоопухолевые.
Также выделяют следующие направления антимикробного действия антибиотиков:
бактерицидное (фунгицидное) действие – вызывающее гибель бактерий и грибов;
бактериостатическое (фунгиостатическое) действие – вызывающее задержку роста и развития бактерий и грибов.
Некоторые из антибиотиков взаимодействуют с рибосомами бактерий, тормозя биосинтез белка в бактериальных клетках и в то же время практически не взаимодействуют с эукариотическими рибосомами. Поэтому они избирательны для бактериальных клеток и малотоксичны для человека и животных (стрептомицин, тетрациклин и т.п.). Один из самых эффективных противотуберкулезных препаратов – антибиотик рифампицин – блокирует работу прокариотических РНК-полимераз – ферментов, катализирующих биосинтез РНК – связываясь с ферментом, но в то же время не обладает способностью связываться с РНК-полимеразами эукариот. Антибиотики взаимодействуют с ДНК и этим нарушают процессы, связанные с размножением и реализацией заложенной в ней наследственной информации. Антибиотики с таким механизмом действия обычно высокотоксичны и в качестве антибактериальных препаратов не используются, а применяются в химиотерапии злокачественных опухолей (актиномицин Д).
Все антибиотики были выделены в ходе систематического скрининга микроорганизмов; число их было существенно увеличено путем химической модификации, цель которой состоит в:
расширении спектра действия и повышения эффективности;
снижении токсичности и устранении нежелательных побочных эффектов;
создании аналогов, устойчивых к разрушению микробами и обладающих, поэтому большим временем «полужизни»;
усовершенствовании способов их введения.
Поскольку микробы могут разрушать антибиотики, возникла необходимость модифицировать природные антибиотики ферментами микроорганизмов, но лишь немногие из этих веществ оказались экономически приемлемыми.
Физиологическое значение антибиотиков для продуцирующих их микроорганизмов неясно. Одни исследователи считают, что синтез антибиотика дает определенные преимущества микроорганизмам-продуцентам в борьбе за существование в природных популяциях. Согласно другой точки зрения, антибиотики представляют собой «отбросы» обмена веществ микроорганизмов и не имеют приспособительного назначения.
Самый богатый источник антибиотиков – организмы, живущие в почве. В почвенных микроэкосистемах чрезвычайно развита конкуренция между обитателями, а антибиотики входят в тот природный «арсенал», который нужен для захвата экологической ниши. Образцы почв из всех районов мира постоянно анализируют в поисках новых сильнодействующих антибиотиков. Одним из самых продуктивных источников антибиотиков служит род Streptomyces. К этому роду принадлежат многие виды актиномицетов, у которых обнаружено и идентифицировано свыше 500 видов антибиотиков.
При оптимизации любого промышленного процесса, протекающего с участием живых организмов, основные усилия бывают направлены на улучшение их генетически обусловленных свойств. Традиционно для повышения продуктивности штаммов используют мутагенез с последующим скринингом и отбором подходящих вариантов.
До «эры» генной инженерии ценные для промышленности штаммы-продуценты антибиотиков с повышенной продуктивностью получали в основном с помощью мутагенеза и селекции природных микроорганизмов. Например, в результате селекции и улучшения техники ферментации промышленный выход пенициллина достиг 20 г/л, что в 10 тыс. раз выше уровня, который имелся в исходном штамме Penicillium.
Характеристика методов селекции.
Селекция – это наука о методах создания сортов, гибридов растений и пород животных, штаммов микроорганизмов с нужными человеку признаками.
Селекция – это направленный отбор мутантов, т.е. организмов наследственность которых претерпела скачкообразное изменение вследствие структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции – это путь от слепого отбора продуцентов к сознательному конструированию их геномов.
Селекцией называют также отрасль сельскохозяйственного производства, занимающуюся выведением новых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур, пород животных. Таким образом, теоретической основой селекции является генетика.
Селекция имеет три направления деятельности, связанные с селекцией растений, животных, микроорганизмов. Селекция микроорганизмов позволяет осуществлять и развивать новое направление человеческой деятельности – биотехнологию, позволяющую утилизировать то, что невозможно утилизировать другими методами.
Кроме отбора в селекцию входят и гибридизация, и направленное воспитание и использование влияния различных факторов на организм в целом и на отдельные его части.
Предмет селекции – это изучение и претворение на практике специфических закономерностей эволюции культурных растений, сельскохозяйственных животных, искусственных штаммов.
Практическое значение селекции: повышение продуктивности и урожайности сельскохозяйственных животных и растений, и эффективности биотехнологических производств.
Методы, применяемые в селекции:
Отбор.
Различают два вида отбора: естественный и искусственный отбор.
Естественный отбор – основной движущий фактор эволюции. Учение о естественном отборе создано Ч. Дарвином (1858 - 1859). Независимо от Ч. Дарвина к идее о естественном отборе пришел А. Уоллес.
Естественный отбор – результат борьбы за существование; выражается в преимущественном выживании оставлении потомства наиболее приспособленными особями каждого вида организмов и гибели менее приспособленных особей. Необходимой предпосылкой для действия естественного отбора является наследственная изменчивость организмов, а непосредственным результатом естественного отбора является формирование приспособлений организмов к конкретным условиям внешней среды. Следствия естественного отбора – увеличение разнообразия форм организмов, последовательное усложнение организации в ходе прогрессивной эволюции, вымирание менее приспособленных видов.
Отбор, проводимый человеком, состоящий в выбраковке особей, не представляющих ценности в хозяйственной деятельности человека и в оставлении для потомства особей с ценными для человека признаками, называется искусственным.
Бессознательным искусственным отбором называется отбор, при котором человек отбирая особей для потомства, не ставит перед собой задачи изменить данный организм в каком-либо направлении, а лишь учитывает определенные качества организма, необходимые ему для улучшения его хозяйственной деятельности.
Целевым или сознательным называют отбор, проводимый селекционерами, состоящий в том, что отбор осуществляется в соответствии с определенной, заранее поставленной целью, когда свойства организмов корректируются в определенном направлении. Целевой отбор может быть единичным, индивидуальным, массовым, методическим (систематическим).
Единичным называют отбор, проведенный однократно из данной группы особей.
Методическим называют отбор, проводимый в течение нескольких поколений с целью выведения форм организма, в наибольшей степени отвечающим нуждам человека.
Индивидуальным называется отбор на уровне конкретных особей данной породы животных или сортов растений.
Массовым называют отбор потомства большого числа особей одновременно.
В селекции используют все вышеперечисленные виды отбора. Отбор сам по себе не дает результата, если у организмов не будут возникать какие-либо изменения, но изменения сами по себе возникают медленно, стихийно и не всегда в нужных направлениях, поэтому селекционеры используют воздействия на организм, при которых такие изменения возникают.
Гибридизация:
Метод гибридизации (скрещивания) состоит в том, что получают потомство от особей, различающихся определенными признаками, которые можно использовать в дальнейшей селекционной работе. Скрещивание позволяет в некоторой степени нарушать консерватизм наследственности, что также способствует селекционной работе. Различают близкородственную, неродственную и отдаленную гибридизацию.
Близкородственной гибридизацией (инбридингом) называют скрещивание, в котором участвуют близкородственные организмы. Инбридинг используют для получения «чистых линий», в которых свойства, присущие данному сорту растений, пород животных выделяются в наиболее концентрированном виде. Подобное выделение признака связано с тем, что генотип родственных организмов близок, а скрещивание этих организмов способствует возникновению гомозиготных форм. При инбридинге наблюдается гибридная депрессия – снижение жизнеспособности и продуктивности за счет близкородственной гибридизации. Получение «чистых линий» находит широкое использование в селекции, т.к. позволяет выявить свойства организмов, важные для хозяйственной деятельности, а затем использовать полученные формы для дальнейшей селекционной работы.
Неродственной гибридизацией называют скрещивание особей данного вида, принадлежащих к разным семьям.
Отдаленная гибридизация – это скрещивание организмов, принадлежащих не только к разным породам, но даже к разным видам.
Осуществление межвидовой гибридизации возможно за счет использования явления полиплоидии – явления, при котором в клетке возникает набор хромосом, в кратное число раз больший, чем это характерно для нормы.
Мутагенез:
Мутагенез – искусственное получение мутаций с помощью мутагенов. Мутации – внезапные качественные изменения генетической информации.
В селекции мутагенез используют для получения перспективных мутантов животных, растений, микроорганизмов. Термин был предложен голланд. ученым де Фризом в 1901 г.
Мутант – наследственно измененная в результате мутации форма организма. Мутанты могут возникать спонтанно, либо под действием мутагенов. Большинство мутантов отличаются от исходных организмов нарушением различных структур и функций и, как правило, имеют пониженную жизнеспособность. Гораздо реже возникают мутанты, обладающие преимуществами. Такие мутанты широко используют для выведения новых сортов растений и пород животных, а также для получения штаммов микроорганизмов - продуцентов аминокислот, витаминов, антибиотиков и других биологически активных веществ. В генетике мутанты используют для изучения закономерностей мутационного процесса – строения и функционирования генетического аппарата, путей биосинтеза и т.п. Мутанты играют очень важную роль в эволюции, т.к. представляют собой материал для естественного отбора.
Мутации – внезапные, естественные или вызванные искусственно наследуемые изменения генетического материала, приводящие к изменению тех или иных признаков организм.
Различают спонтанные мутации, возникающие с относительно низкими частотами, а также индуцированные мутации, вызываемые воздействием мутагенов.
Выделяют три основные группы мутагенов:
К физическим мутагенам относят нагревание, различные виды ионизирующих излучений, ультрафиолетовое и микроволновое излучение. Первичный эффект ионизирующих и ультрафиолетовых излучений заключается в образовании одиночных или двойных разрывов в молекуле ДНК.
Мутагенным действием обладают многие химические соединения различного строения (алкилирующие соединения, нитрозосоединения, антибиотики, обладающие противоопухолевой активностью). Химические мутагены делят на мутагены прямого действия, непосредственно взаимодействующие с генетическим материалом клетки и мутагены непрямого действия, влияние которых на генетический материал клетки практически опосредованно, после ряда метаболических превращений. Однако в отличие от ионизирующих и ультрафиолетовых излучений для химических мутагенов характерна специфичность действия, зависящая от природы объекта и стадии развития клетки. При взаимодействии химических мутагенов с компонентами наследственных структур (ДНК и белками) возникают первичные повреждения последних, которые ведут к возникновению мутаций.
К биологическим мутагенам относят ДНК- и РНК-содержащие вирусы, некоторые полипептиды, белки, ряд ферментов рестриктаз, и т.п. Механизм образования мутации при действии различных биологических факторов не вполне ясны, однако агенты, содержащие нуклеиновые кислоты, могут вызывать нарушение процессов рекомбинации, что приводит к возникновению мутаций.
Мутации называют прямыми, если их проявление приводит к отклонению признаков от дикого типа, и обратными (или реверсиями), если их проявление приводит к полному или частичному восстановлению дикого типа.
Мутации бывают генеративными (происходит в половых клетках и в этом случае передается последующим поколениям), соматическими(происходит в любых других соматических клетках организма и в этом случае наследуется только при вегетативном размножении), ядерными (затрагивают хромосомы ядра), цитоплазматическими (затрагивают генетический материал, заключенный в цитоплазматических органоидах клетки – митохондриях, пластидах и т.п.).
По характеру изменения генотипа различают:
Генные мутации представляют наследственные, микроскопически не выявляемые изменения в хромосомах. Генные мутации сопряжены либо с заменой пары азотистых оснований в полинуклеотидной цепи ДНК, либо с вставкой или выпадением нескольких отдельных нуклеотидов.
Хромосомные мутации (хромосомные абберации) разделяют на внутрихромосомные и межхромосомные. К внутрихромосомным мутациям относят делецию (утрата части хромосомы), дупликацию (удвоение части хромосомы) и инверсию (изменение последовательности расположения генов по длине хромосомы за счет перевертывания – инверсии участка хромосомы на 180 С). К межхромосомным мутациям относят транслокацию – обмен участками между двумя хромосомами.
Геномные мутации заключаются в изменении числа хромосом. Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору хромосом, называют полиплоидией. Отсутствие или избыточное количество отдельных хромосом объединяют понятием анеуплоидия, которую подразделяют на гиперплоидию (увеличение числа хромосом) и гипоплоидию (потерю отдельных хромосом хромосомного набора). Геномные мутации возникают за счет повреждений в процессе мейоза ведущих к нерасхождению хромосом или хроматид по дочерним клеткам.
Мутационный процесс у микроорганизмов можно использовать более эффективно, чем у высших организмов, т.к. геном микроорганизмов гаплоидный, что позволяет выделять любые мутации в первом поколении. Преимущества микроорганизмов заключаются также в: простоте генетической организации бактерий по сравнению с эукариотами, более простой генетической регуляции, отсутствии или не столь сложном взаимодействии генов. Используя методы генетической инженерии можно заставить бактерии или другие группы микроорганизмов продуцировать те соединения, синтез которых в дикой природе им никогда не был присущ.
Скрининг.
В основе скрининга лежит тотальная проверка полученных клонов. Отобрав наиболее продуктивные клоны, повторяют обработку тем же или другим мутагеном, вновь отбирают наиболее продуктивный вариант и т.д., т.е. здесь речь идет о ступенчатом отборе по интересующему признаку.
Скрининг веществ с целью обнаружения медикаментов так же стар, как и сама медицина. Практически все антибиотики были найдены в результате испытания супернатана (осадочной жидкости) посевов микроорганизмов на наличие веществ, которые могут тормозить рост патогенных микроорганизмов. Современные полусинтетические антибиотики являются результатом химической модификации базового вещества, полученного с применением биотехнологии.
При оптимизации любого промышленного процесса, протекающего с участием живых организмов, основные усилия бывают направлены на улучшение генетически обусловленных свойств. Традиционно для повышения продуктивности штаммов используют мутагенез с последующим скринингом и отбором подходящих вариантов.
В прошлом для увеличения продуктивности штаммов обычно использовали мутагенез и отбор: именно таким путем удалось повысить выход антибиотиков, синтезируемых грибами и актиномицетами. Было последовательно отобрано свыше 20 штаммов, продуцирующих все больше пенициллина, и, в конечном счете, продуктивность увеличилась в 55 раз. Как в этом случае, так и во многих других отбора не происходило, поскольку не удавалось создать условия, при которых росли бы только искомые штаммы.
Вместо этого пришлось применять метод скрининга: клетки, выжившие после воздействия больших доз мутагенов, размножали в колбах на качалках, после чего в фильтратах культуральной жидкости определяли количество антибиотика.
Скрининг требует много времени и напряженного труда, т.е. скрининг – трудоемкий метод. Часто штаммы, для которых был получен большой выход при выращивании в колбах, оказывались непродуктивными в условиях роста в ферментере большого объема. Нередко успеху способствовало знание «секретов мастерства»: так, оказывается, что большая продуктивность обычно свойственна особым морфологическим вариантам. Недостатком метода также является отсутствие сведений о характере мутаций, исследователь проводит отбор по конечному результату.
Так, если речь идет о штаммах бактерий, устойчивых к тяжелым металлам, то устойчивость может быть обусловлена мутациями разных типов: а) подавлением системы поглощения катионов металлов бактериальной клеткой; б) активацией выброса поглощенных катионов из клетки; в) перестройкой систем, чувствительных к ингибирующему действию тяжелых металлов.
Шанс на удачу при «скрининге наугад» исключительно низок. Поэтому разработаны методы скрининга, открывающие исключительно большие возможности. Обнаружение хорошего «ведущего состава» возможно с помощью простых, быстрых и селективных методов определения («сито»). Метод может представлять собой чаще всего автоматизированный тест, который позволяет легко установить, связывается ли вещество из библиотеки веществ с клонированным человеческим рецептором или энзимом.
После того как вещество отобрано, должно быть установлено, обладает ли оно и если да, то в какой степени, антагонистической или агонистической активностью. Для этого могут быть проведены функциональные испытания, с помощью которых, например, может быть установлено, ведет ли связывание лиганда с рецептором к передаче сигнала. При современных биотехнологических методах скрининга все чаще используются клетки, в которых клонированный рецептор или энзим сцепляется с простой для определения системой считывания. Так, получены клетки, которые начинают расти или изменять цвет или форму только после стимуляции клонированного рецептора. Подобные методы позволяют проверить ежегодно многие тысячи веществ на наличие желаемых биологических свойств.
Скрининг с использованием чашек с агаром вместо колб на качалках позволяет обследовать гораздо больше мутантов. Образование антибиотиков или метаболитов нередко оценивается методом биологических проб, когда в агар вводят индикаторные организмы. Разработаны устройства для автоматического скрининга чашек. В них используются механические приспособления для инокуляции, и производится периодическое фотографирование и последующий компьютерный анализ изображений.
Можно создавать особые условия, при которых мутанты с нужными свойствами не растут. В этом случае применяется так называемый метод обогащения, когда активно растущие клетки дикого типа погибают, а не растущие мутантные выживают.
Так, например, пенициллин или нистатин вызывает гибель растущих клеток бактерий или грибов соответственно. При работе с грибами недостаток в среде инозитола приводит к автолизу растущих, но не покоящихся клеток.
Наиболее подходящим способом является, конечно, прямой отбор, когда создаются условия для роста только мутантных клеток. Этот подход применялся для выделения штаммов – сверхпродуцентов некоторых метаболитов, например аминокислот и цитрата. Обработанную мутагеном культуру выращивают в присутствии ингибитора (например, аналога аминокислоты), в результате чего отбираются мутанты, преодолевающие нарушение обмена за счет образования избытка желаемого соединения.
Отбор на чашках с агаром основан на том, что часть организмов отвечает на воздействия по принципу «все или ничего». Колонии мутантов растут, а диких клеток – нет. Однако при получении промышленных штаммов, особенно предназначенных для использования в длительных процессах ферментации, нередко стремятся получить для конкретных условий относительно небольшие различия в скорости роста. В этом случае отбор происходит при непрерывном культивировании. В хемостатах при длительном выращивании культура все время находится в экспоненциальной фазе роста, и это позволяет выделять даже те мутанты, у которых сродство к субстрату, удельная скорость роста или устойчивость к токсическому действию высоких концентраций субстрата или продукта лишь немного превышает исходный уровень.
Промышленное производство антибиотиков.
Процесс промышленного производства антибиотиков включает в себя следующие стадии:
подготовка питательно среды (среда должна обеспечивать максимальное накопление клеток и синтез антибиотиков, содержать дешевые и доступные компоненты, обеспечивать экономичные приемы выделения и очистки, обладать хорошей фильтрующей способностью).В технологии получения антибиотиков путем культивирования микроорганизмов возможно применение твердых питательных сред: с этой целью применяют агаризованные или сыпучие субстраты (пшено, ячмень, пшеничные отруби и т.п.) и жидких питательных сред.
Условия синтеза антибиотиков:
Стерильность.
Отсутствие посторонней микрофлоры при культивировании продуцентов антибиотиков – важнейший фактор биотехнологического процесса. Для обеспечения стерильности процесса вся аппаратура и коммуникации герметизируются, стерилизуются и держаться под давлением. Питательная среда и воздух для аэрации также стерилизуются. Засев ферментера, отбор проб на анализ проводится в асептических условиях.
Развитие посторонней микрофлоры опасно во многих отношениях:
Посторонняя микрофлора, развиваясь в питательной среде, видоизменяет ее и тем самым нарушает оптимальные условия биосинтеза, что уменьшает уровень накопления антибиотика.
Наличие посторонней микрофлоры затрудняет дальнейшую обработку культуральной жидкости, отделение ее от мицелия и приводит к получению некачественного нативного раствора.
Продукты жизнедеятельности посторонних микроорганизмов могут загрязнять получаемый антибиотик и снижать ее качество.
Питательная среда.
Условия синтеза антибиотиков заключаются в том, что в питательной среде должны присутствовать источники азота, углерода, фосфора, а также предшественники антибиотиков и витамины. К источникам азота относятся - аминокислоты, аммонийные соли и иногда нитраты; к источникам углерода – глюкоза и лактоза, также в питательной среде должны присутствовать такие элементы как сера, магний, марганец, железо, цинк, кобальт. Кроме того, при производстве антибиотиков в состав питательной среды должны входить соевая мука, кукурузный экстракт, жмых масленичных культур.
РН.
Для бактерий рH питательной среды составляет приблизительно 7, для грибов – 4,5 –5, для актиномицетов – 6,7 - 7,5.
Для большинства известных антибиотиков оптимальный рН близок к нейтральному. При значительном закислении или защелачивании среды процесс биосинтеза тормозится. Многие антибиотики в щелочных или кислых средах неустойчивы и легко инактивируются.
Для регулирования рН в питательные среды для получения антибиотиков часто добавляют некоторое количество мела, который вступает в реакцию с возникающими в ходе процесса метаболизма кислотами, образуя при этом нейтральные соли и углекислый газ, впоследствии удаляемый из среды.
Температура.
Для биосинтеза каждого антибиотика требуется определенная температура. Так, для биосинтеза пенициллина грибом рода пеницилиум оптимальной температурой является 25 – 26 С, в то время как при образовании антибиотиков актиномицетами обычно поддерживают более высокую температуру 27 – 29 С.
В процессе ферментации вследствие интенсивно протекающих процессов выделяется значительное количество тепла, поэтому для поддержания оптимальной температуры необходимо постоянное охлаждение среды.
Перемешивание и аэрация.
Так как продуценты антибиотиков являются аэробами, следовательно, требуется создать при их синтезе хорошую аэрацию. Во время ферментации происходит одновременно два процесса – растворение кислорода в питательной среде и потребление кислорода микроорганизмом. Микроорганизмы используют для дыхания только растворенный в среде кислород, поэтому обеспеченность микроорганизма кислородом определяется скоростью его растворения в культуральной жидкости.
При глубинном культивировании микроорганизмов в помышленных масштабах этот процесс осуществляется путем пропускания воздуха через питательную среду и культуральную жидкость с помощью специальных аэрирующих приспособлений – барботеров. При этом жидкость интенсивно перемешивается.
Основное назначение аэрации и перемешивания – это снабжение культуры кислородом, но одновременно эти процессы способствуют поддержанию мицелия в равномерно взвешенном состоянии и выравниванию концентрации питательных веществ и продуктов обмена в культуральной жидкости.
Вспенивание.
Питательные среды, применяемые при получении антибиотиков, содержат вещества, способные образовывать весьма стойкие пены. Эти вещества могут образовываться в процессе ферментации. Аэрация и перемешивание среды вызывают образование слоя пены на поверхности жидкости, что ухудшает условия развития продуцента.
Пеногашение осуществляется главным образом путем добавления поверхностно активных веществ, способствующих снижению стойкости пена и в дальнейшем ее разрушению.
Подготовка посевного материала (продуценты-мутанты колба на качалке первый инокулятор (10 л) второй инокулятор (100-500 л) ферментер),
Ферментация (для получения антибиотиков используют методы поверхностного и глубинного культивирования).
Промышленная ферментация – специализированный процесс получения различных веществ в химической или родственной отраслях промышленности с помощью микроорганизмов, включая процесс их размножения.
Современная ферментационная установка состоит из нескольких небольших емкостей ферментеров для инокуляции (получения посевного материала) и ферментера большого размера (от 1 л до 1000 м3) для проведения конечной стадии получения целевого продукта. Эти емкости соединены между собой с помощью фиксированных трубопроводов или гибких шлангов. В ферментерах часто используют механическое перемешивание. Кроме того, ферментационные установки могут включать в себя установки для обработки сырья, емкости для приготовления питательной среды, оборудование для непрерывной стерилизации или варочные котлы, установки для получения пара высокого давления и больших объемов стерильного воздуха для аэробной ферментации.
Выделение антибиотиков (методы выделения целевого продукта различаются в зависимости от локализации антибиотиков: экстракция органическими растворителями, осаждение в виде нерастворимого комплекса, сорбция на ионообменных смолах),
Очистка антибиотиков (данная стадия технологического процесса включает в себя следующие этапы: осаждение, сорбция, сушка),
Получение готового продукта (упаковка, фасовка).
Антибиотикорезистентность микроорганизмов.
Одновременно с расширением области применения антибиотиков увеличилось число патогенных штаммов микроорганизмов, проявляющих повышенную устойчивость к отдельным или нескольким антибиотикам, что привело к снижению, а в ряде случаев к потере эффективности примененных препаратов.
Появление устойчивых штаммов микроорганизмов обусловлено включением в рацион антибиотиков в качестве кормовых добавок. У поросят, получавших с кормом хлортетрациклин, выделяли кишечные палочки, устойчивые не только к этому препарату, но и к стрептомицину, левомицитину и сульфаниламидам. Признак устойчивости при конъюгации передавали 40% таких штаммов.
Увеличение числа резистентных микроорганизмов вызвало необходимость детального изучения причин появления факторов, способствующих их распространению и последующей разработки методов предупреждения и преодоления лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний.
Различают природную устойчивость, связанную с особенностями данного вида микроорганизмов, приобретенную устойчивость и трансмиссивную лекарственную устойчивость.
Примером природной устойчивости может служить невосприимчивость к бензилпенициллину эшерихий, которая основана на особенностях структуры их оболочки, затрудняющей доступ антибиотика к чувствительному субстрату.
Приобретенная устойчивость развивается благодаря способности отдельных бактериальных клеток к мутации, которая не является направленной и не связана с воздействием лекарственных веществ. В результате же применения антибиотика, который в этом случае играет роль селективного агента, чувствительные клетки погибают, а устойчивые мутанты выживают, размножаются и становятся источником распространения антибиотикорезистентных штаммов.
С генетической точки зрения приобретенная устойчивость есть приобретение клеткой нового признака, который не отражается на таксономическом положении бактерий, и может быть утрачен без изменения остальных признаков. По скорости возникновения приобретенная устойчивость делится на два типа: стрептомициновый, возникающий путем одноступенчатой мутации, когда устойчивые мутанты популяции выявляются после одно-, двукратного контакта с антибиотиком, и пенициллиновый, возникающий путем многоступенчатых мутаций, когда устойчивые мутанты популяции выявляются после многократного контакта с антибиотиком.
Комитетом экспертов ВОЗ одобрено два определения устойчивости бактерий. В клиническом смысле микроорганизм условно может быть признан устойчивым, если он переносит концентрацию антибиотика, которую не представляется возможным достичь в месте инфекции. Устойчивость в клиническом аспекте обусловлена также токсичностью антибиотика, которая может ограничивать дозу вводимого препарата. С бактериологической точки зрения микроорганизм устойчив, если он переносит более высокие концентрации препарата, чем другие штаммы того же вида. Поэтому «устойчивость» - понятие относительное и может считаться абсолютным только в том случае, если микроб совершенно лишен каких-либо структур, на которые действует антибиотик. Например, L-формы бактерий, не имеющие клеточной стенки, являющейся местом действия пенициллина, абсолютно устойчивы к этому антибиотику.
В зависимости от механизма, лежащего в основе приобретенной устойчивости бактерий к антибиотикам, различают ферментативный и толерантный типы устойчивости. Ферментативная устойчивость – это способность бактерий инактивировать антибиотик с помощью специфических энзимов (бета-лактамаза, амидаза и др.).
Трансмиссивная лекарственная устойчивость возникает в результате переноса от клеток-доноров клетками-реципиентами ДНК-содержащего генетического материала, находящегося в хромосомах или расположенного вне хромосом.
Внехромосомные ДНК-содержащие элементы относятся к классу плазмид (эписом). Плазмиды, ответственные за передачу резистентности, носят название R-факторы. Они содержат детерминанты резистентности к антибиотикам и единицы переноса RTF. Для переноса резистентности необходимо сочетание этих генетических структур. Один R-фактор может содержать детерминанты резистентности одновременно к двум и более антибиотикам. Происхождение R-факторов не зависит от применения антибиотиков. Последние в качестве селективных веществ способствуют лишь отбору штаммов-носителей R-факторов. Широкое распространение R-факторов связано главным образом с наличием природного резервуара бактерий-носителей R-факторов (домашние животные, птицы, рыбы, человек и др.), а также с возможностью межбактериальной передачи R-факторов от непатогенных видов патогенным с помощью трех механизмов: трансформации, трансдукции, конъюгации.
Трансформация – процесс передачи ДНК-содержащих материалов от лизированных клеток клетками-реципиентами – представляет собой крайне редкий путь передачи резистентности.
Трансдукция – процесс передачи генетического материала от клеток-доноров клетками-реципиентами с помощью фага – отмечена у стафилококков и энтерококков.
Конъюгация – половой процесс передачи генетического материала при прямом контакте клеток через плазматические мостики – является преобладающим путем передачи резистентности от микробов-доноров микробам-реципиентам одного или разных видов. Передача резистентности конъюгаций установлена для сальмонелл, эшерихий, шегел и других граммотрицательных микроорганизмов.
Широкое распространение носительства R-факторов среди патогенных и непатогенных микроорганизмов, изолированных от сельскохозяйственных животных, свидетельствует о серьезной угрозе снижения эффективности антибиотиков и необходимости изыскания способов предупреждения и подавления передачи R-факторов.
Значительное число исследований посвящено разработке методов подавления межбактериальной передачи резистентности к антибиотикам. Установлено, что некоторые антибиотики (стрептомицин, неомицин, рифампицин, полимексин), нитрофурановые препараты (фурагин, фуразолин), пиронин, кофеин и другие вещества препятствуют передаче трансмиссивной устойчивости к антибиотикам. Одновременно с этим ведутся исследования, направленные на разработку способов преодоления резистентности микроорганизмов к антибиотикам. Учитывая, что хромосомный и плазмидный тип резистентности микроорганизмов к антибиотикам обусловлен субклеточными молекулярными структурами, состоящими из ДНК, представляется возможным применение ДНК-тропных соединений, обладающих свойством элиминировать R- и RTF-факторы или необратимо нарушать генетические функции бактериальной хромосомы. Такими свойствами обладают хинакрин, акрифлавин, митомицин С и некоторые другие вещества. Принимая во внимание, что у резистентных бактерий снижается способность поглощать антибиотики, предприняты попытки изменить чувствительность бактерий к антибиотикам одновременным применением мембранотропных и поверхностно-активных веществ, способных увеличивать проникновение антибиотиков в микробную клетку. Среди испытанных веществ наиболее перспективными оказались протамин, гистоны, имидазолин, а также антибиотики микробомицин и флавомицин. Целесообразен также поиск веществ, повышающих чувствительность к антибиотикам белоксинтезирующей системы бактерий. В частности, отмечено, что протамин гидрохлорид снижает резистентность бактерий к хлорамфениколу.
Большое внимание исследователи разных стран уделяют изучению возможности подавления выделяемых бактериями ферментов, инактивирующих бета-лактамиды, аминогликозиды, хлорамфеникол. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что наиболее активно угнетают пенициллиназы или элиминируют пенициллиназные плазмиды аниооные детергенты (сульфанол), 3,6-диаминоакридные (профлавин, акрифлавин) и производные антибиотиков (сульфанид феноксиметилпенициллина, оксациллин, цефалотин, цефалоридин). Обнаружены также вещества, подавляющие процесс инактивации хлорамфеникола: производные трифенилметанового ряда, протамин гидрохлорид, пенициллин.
Несомненно, что проведенные эксперименты послужат основой для разработки приемлемых методов борьбы с антибиотикорезистентностью штаммов микроорганизмов. Практически же проблема повышения эффективности антибиотиков в настоящее время решается несколькими путями, наиболее эффективны из которых следующие:
поиск новых природных антибиотиков, эффективных против болезней, вызываемых резистентными штаммами микроорганизмов;
получение новых препаратов с лучшими антимикробными фармакокинетическими параметрами путем направленной химической трансформации молекул природных антибиотиков;
применение сочетаний двух или нескольких антибиотиков с различными механизмами антимикробного действия или антибиотиков с другими терапевтическими веществами с целью затруднить развитие резистентности у возбудителей заболевания и снизить токсичность отдельных компонентов за счет уменьшения дозы каждого из них.
Определение антимикробной активности антибиотиков.
Определение антимикробной активности антибиотиков сводится к определению антибиотикограммы – показателя чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Определение антибиотикограммы является основным этапом микробиологической диагностики, обеспечивающей выбор оптимального препарата для антибактериальной терапии.
Ведущим методом определения антимикробной активности антибиотиков является дискодиффузионный метод, отличающийся простотой выполнения и экономичностью. Метод основан на измерении диаметра зон задержки роста испытываемого микроорганизма вокруг диска с антибиотиками.
Дискодиффузионный метод:
Взвесь изучаемой культуры засевают «газоном». В качестве посевного материала используют суточную бульонную культуру или одну миллиардную микробную взвесь. Засеянные чашки высушивают 30 – 40 мин. при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянного агара пинцетом помещают бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Каждый диск слегка прижимают, чтобы он плотно прилегал к поверхности агара. Диски помещают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. Одну чашку можно использовать для изучения чувствительности одного штамма к 4 – 5 антибиотикам.
Засеянные чашки с нанесенными на них дисками помещают в термостат при 37 С на 18 – 24 ч. Чашки ставят вверх дном, чтобы избежать попадания конденсационной воды на поверхность посевов.
Учет результатов:
Действие антибиотиков оценивается по феномену задержки роста вокруг диска. Диаметр зон задержки роста определяют с помощью линейки, включая диаметр самого диска. Между степенью чувствительности микроба к антибиотикам и величиной зоной отсутствия роста имеются следующие соотношения:
-
Степень чувствительности микроба к антибиотику
Диаметр зоны отсутствия роста, мм
Чувствительные
Больше 10
Малочувствительн.
Меньше 10
Устойчивые
Полное отсутствие
Методы последовательных (серийных) разведений антибиотиков в жидкой или плотной питательной среде.
Основным достоинством данного метода является высокая точность, а недостатком данного – громоздкость. При применении метода серийных разведений антибиотик разводят в пробирках с жидкой питательной средой и засевают в них одинаковое количество бактерий. Учет результатов проводят по отсутствию или наличию роста бактерий.
Метод серийных разведений в жидкой питательной среде:
Для постановки опыта необходимо иметь чистую культуры испытуемого микроорганизма, основной раствор антибиотика, мясопептонный бульон на переваре Хоттингера, содержащего 1,2 – 1,4 г/л аминного азота.
Для приготовления основного раствора антибиотика используют антибиотики, имеющиеся в продаже с указанием количества их во флаконе. Из этого раствора и должны быть приготовлены требуемые разведения антибиотиков.
Готовят взвесь культуры микроорганизмов, выращенную на плотной питательной среде. Затем разводят стерильным изотоническим раствором натрия хлорида до 106 микробных тел в 1 мл. Для получения соответствующего разведения микробной взвеси готовят ряд последовательных десятикратных разведений.
Постановка опыта:
В 12 стерильных пробирок разливают по 1 мл жидкой питательной среды. В первую пробирку вносят 1 мл основного раствора антибиотика, содержимое первой пробирки перемешивают и 1 мл переносят во вторую пробирку, из второй - в третью, из третей – в четвертую и так до десятой, из которой 1 мл удаляют. Таким образом, первая пробирка будет содержать 16 ЕД, вторая – 8 ЕД и т.д. Для приготовления каждого разведения используют отдельную пипетку. Содержимое одиннадцатой пипетки служит контролем роста бактерий, а двенадцатой – контролем стерильности питательной среды.
Во все пробирки кроме двенадцатой вносят 0,1 мл испытуемой культуры определенной густоты. Посев инкубируют в термостате в течение 18 – 24 ч и регистрируют результаты опыта.
Учет результатов:
Проводят при наличии роста в контроле культуры и отсутствии роста в контроле культуры. Затем отличают последнюю пробирку с полной видимой задержкой роста микробов. Количество антибиотика в этой пробирке является минимальная подавляющая концентрация антибиотика (МПК) для испытуемого штамма и определяет степень его чувствительности к данному антибиотику.
Метод серийных разведений на плотной питательной среде.
Готовят двукратные разведения антибиотика, как и при методе серийных разведений в жидкой питательной среде. Затем берут одну часть каждого разведения антибиотика и девять частей питательного агара, расплавленного и охлажденного до 42 С (из расчета 1 мл антибиотика плюс 9 мл мясопептонного агара (МПА)), хорошо перемешивают и наливают в чашку Петри.
Густоту (концентрацию) культуры определяют по оптическому стандарту мутности №10 и разводят стерильным изотоническим раствором до 107 микробных тел в 1 мл. Бактериальной петлей наносят испытуемые культуры на поверхность питательного агара с антибиотиком. На одну чашку делают посев 20 – 25 штаммов. Засеянные чашки ставят в термостат при 37 С на 16 – 20 ч для большинства видов микроорганизмов. Чашка с питательным агаром без антибиотика, на которую наносят испытуемые культуры – контрольная.
Учет результатов:
Учет результатов опыта проводят при наличии роста в контрольной чашке, а МПК антибиотика определяют по последней чашке Петри, где отличают полную задержку роста бактерий.
Метод дорожки по Флемингу.
Метод применяют для определения спектра действия антибиотика. В чашке Петри с мясопептонным агаром стерильным скальпелем вырезают дорожку шириной 1 см и удаляют ее. Затем в пробирку с растопленным и охлажденным до 42 – 45 С мясопептонным агаром вносят определенную концентрацию раствора антибиотика. Содержимое пробирки перемешивают и выливают в дорожку так, чтобы жидкость не выходила за ее пределы. После засевания агара перпендикулярно к дорожке засевают петлей культуры нескольких исследуемых микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на 18 – 24 ч.
Учет результатов:
Чувствительные к препарату культуры начинают расти лишь на некотором расстоянии от дорожки, нечувствительные растут до самого края.
Мерой чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам при использовании этих методов служит минимальная подавляющая концентрация (МПК) –это наименьшая концентрация антибиотика, которая подавляет развитие штамма бактерий при стандартных условиях постановки опыта и выражается в абсолютных единицах действия (мкг/мл).
Критерии чувствительности микроорганизмов к антибиотикам зависят не только от особенностей самих микроорганизмов, но и от концентрации антимикробного препарата в патологическом очаге, его фармакокинетических и фармакодинамических свойств (величины максимальной терапевтической дозы, токсичности и т.д.).
Для подбора эффективных комбинаций антибактериальных препаратов в лабораторной практике пользуются качественным дискодиффузионным методом: при этом диски, пропитанные антибиотиками наносят на чашки Петри, засеянные исследуемой культурой возбудителя, на расстоянии равном или несколько большем, чем сумма радиусов зон подавления его роста. Эффект может быть разнообразным: индифферентным (независимым), если после инкубации имеются две независимые зоны подавления роста возбудителя вокруг каждого из дисков; синергидным (потенцированным) или аддитивным (суммарным) при слиянии зон подавления роста; антагонистическим, когда зоны подавления роста уменьшаются в части обращенной друг к другу.
Применяют также диски, пропитанные одновременно двумя препаратами. При этом для сравнения зон подавления роста возбудителя одновременно используют диски, содержащие по одному из данных препаратов. Если зона вокруг двойного диска больше, то говорят об аддитивном или синергидном эффекте, если меньше – об антагонизме.
Задание 2: Выполнить лабораторную работу.
Приготовить агаризованную питательную среду для посева на нее микроорганизма-продуцента антибиотика.
Произвести посев культуры-продуцента антибиотика на агаризованную среду в чашки Петри.
Подготовка агаризированной среды для посева на нее микроорганизма-продуцента антибиотика.
Колбу со стерильной агаризированной средой поместить на водяную баню для расплавления агар-агара. При этом следует периодически перемешивать содержимое колбы медленным вращательным движением.
В чашки Петри обычно разливают агаризованную среду охлажденную до 70 – 80 С. Для этого колбу с расплавленной средой выдержать на столе до постепенного ее остывания при комнатной температуре (10 минут) и затем разлить в стерильные чашки Петри.
Для этого колбу со средой взять в правую руку, вынуть из нее пробку, зажимая ее мизинцем и безымянным пальцем левой руки. Слегка обжечь горло колбы в пламени спиртовки. Затем прикрыть крышку чашки Петри левой рукой и быстро налить в чашку расплавленную среду в таком количестве, чтобы дно чашки было полностью покрыто. Вращательным движением повернуть чашку на столе для того, чтобы среда равномерно распределилась по дну чашки, и оставить на столе до полного застывания агара.
Примечание. 100 мл агаризованной среды, приготовленной на подгруппу, разливают на 5 – 6 чашек Петри. Каждый студент должен произвести посев культуры продуцента на агаризованную среду.
Посев культуры продуцента антибиотика на агаризованную среду в чашки Петри.
Протереть поверхность стола дезинфицирующим раствором.
Зажечь спиртовку.
Пробирку с продуцентом антибиотика взять в левую руку таким образом, чтобы хорошо была видна вся поверхность питательной среды с выросшей на ней культурой. Пробирка должна находится в горизонтальном положении или несколько наклонно.
Взять в правую руку бактериологическую петлю и простерилизовать ее в пламени горелки.
Не выпуская из руки петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать ватную пробку к ладони, вынуть ее из пробирки и держать ее так во время последующих манипуляций.
Ввести петлю в пробирку и захватить небольшое количество материала, содержащего микроорганизмы, с поверхности агара. Закрыть пробирку пробкой и положить ее на стол.
Приподнять крышку чашки Петри левой рукой и бактериологической петлей слегка коснуться поверхности агара и провести зигзагообразную черту – штрих. Петлю обжечь в пламени горелки, чтобы уничтожить оставшиеся на ней микроорганизмы.
Чашку Петри с посеянной культурой продуцента антибиотика подписать карандашом по стеклу и поставить в термостат при 28 С.
Продолжительность выращивания продуцента на агаризованной среде 8 – 10 суток.
Литература:
Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.
Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.
Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: Агропромиздат. – 1990.
Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.
Малая медицинская энциклопедия: В 6-ти томах/ Под ред. Покровского В.И. – М.: Советская энциклопедия. – Т.1. – 1991. – 560 с.
Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416с.
Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987. – 410с.
Словарь по биотехнологии / Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.
Лекционный материал по биотехнологии.
Энциклопедия по безопасности и гигиене труда./ Перев. с англ.// Под ред. Сухорученкова Г.Ф. Т. 4, Ч. 1. – М.: Профиздат. – 1987.
Темы рефератов.
Скрининг продуцентов биологически активных веществ из почвенных микроорганизмов.
Механизм регуляции биосинтеза вторичных микробных метаболитов.
Методы скрининга продуцентов микроорганизмов при получении антибиотиков.
Биосинтез антибиотиков.
Пути создания высокоактивных продуцентов антибиотиков.
Механизмы резистентности бактерий к антибиотикам.