Занятие 4.
ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Ферменты медицинского назначения. Методы выделения и оценки ферментов микробного происхождения. Лекарственные формы.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:Рассмотрение основных областей применения ферментов в медицине. Изучение особенностей выделения и очистки ферментов.
Вопросы, выносимые на семинар:
Охарактеризуйте основные сферы применения ферментных препаратов.
Поясните возможности применения ферментов в области диагностики различных заболеваний.
Поясните особенности применения ферментов в тонком органическом синтезе.
Приведите классификацию ферментов.
Введите понятие фермента. Укажите специфические свойства ферментов, отличающие их от других катализаторов. Поясните «принцип действия» ферментов.
Перечислите и охарактеризуйте основные источники получения ферментов.
Поясните преимущества синтеза ферментов с помощью микроорганизмов.
Рассмотрите возможности микробиологического получения ферментов. Перечислите и поясните основные этапы промышленного биотехнологического производства ферментов.
Расскажите об особенностях выделения внеклеточных ферментов из культуральной жидкости и охарактеризуйте применяемое на этой стадии оборудование.
Объясните особенности выделения внутриклеточных ферментов и охарактеризуйте применяемое на этой стадии оборудование.
Охарактеризуйте методы очистки ферментов после их выделения. Поясните особенности ультрафильтрационной очистки.
Рассмотрите особенности хроматографических методов очистки выделенных ферментов (гель-фильтрация, ионообменная хроматография, обращенно-фазовая хроматография, аффинная хроматография).
Перечислите, от каких факторов зависит выбор методов выделения и очистки ферментов.
Охарактеризуйте особенности оценки качества выделенных и очищенных ферментов.
Перечислите основные методы определения активности ферментов.
Задание 1: Изучить учебный материал.
Учебный материал.
Возможности применения ферментов.
В биотехнологии лекарственных средств существенное место занимают препараты, отличающиеся высокой избирательностью действия. В настоящее время с успехом используют ферментные препараты различного назначения, для заместительной терапии, а также широко используется в медицинской практике для терапии ряда заболеваний, дезинфекции и заживления ран, рассасывания тромбов, при лечении воспалительных процессов, и, наконец, в клинической диагностике. Особое значение ферментативные методы приобретают при диагностике заболеваний сердца, печени и некоторых видов злокачественных новообразований, примером этого служит:
Увеличение в крови человека в первые часы после инфаркта миокарда количества креатинкиназы – фермента, содержащегося в мышечной ткани, является решающим при диагнозе данного заболевания.
Рассмотрим ряд примеров использования ферментов в медицинской диагностике:
Так, например, холестериноксидаза позволяет определить уровень холестерина в сыворотке крови, а уреаза – уровень мочевой кислоты.
Ферментные препараты нашли широкое применение в различных отраслях промышленности (медицинской, пищевой, легкой, химической), а также в сельском хозяйстве. В настоящее время сформировалась ферментная промышленность, включающая в себя как получение высокоочищенных индивидуальных ферментов, так и широкое их практическое использование.
Применение ферментных препаратов в медицине. Ферментные препараты используют для растворения тромбов, лечения наследственных заболеваний, удаления нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых фрагментов, освобождение организма от токсических веществ. Яркий пример – спасение жизни больных с тромбозом конечностей, легких, коронарных сосудов сердца при помощи тромболитических ферментов – стрептокиназы, урокиназы. В настоящее время созданы и иммобилизованные формы таких ферментов.
В современной медицине протеазы применяются для очистки очагов гнойно-некротических процессов от патологических продуктов, а также для лечения ожогов. Лечение рака L-аспарагиназы, которая лишает раковые клетки ресурсов необходимого для их развития аспарагина, поступающего с током крови.
Известно около 200 наследственных заболеваний, обусловленных дефицитом ферментов. В настоящее время делают попытки лечения этих заболеваний с применением ферментов. Так, пытаются лечить болезнь Гоше, при которой организм не способен расщеплять глюкоцеребрезиды.
Применение ферментов в тонком органическом синтезе оправдано, прежде всего, в тех случаях, когда молекулы, подлежащие химической перестройки достаточно сложны, содержат близкие по своим свойствам химические связи, из которых затрагиваться должна только одна (или лишь некоторые из них). Поэтому ферменты незаменимы при синтезе производных стероидов, алкалоидов, простагландинов и других природных веществ сложной структуры.
Например, молекулы бензилпенициллина содержит две связи СО-N, одна из которых расположена в боковой цепи, а другая входит в состав четырехчленного цикла. Воздействовать на одну из этих связей чисто химически, не затронув другую, практически невозможно; а вот фермент пенициллинамидаза способен отщеплять боковую цепь, совершенно не затрагивая цикла.
Модификация алкалоида тропана: фермент химотрипсин атакует только одну из двух сложноэфирных связей молекулы этого вещества, обладающих с точки зрения химика, примерно одинаковой реакционной способностью.
Многие ферменты способны отличать не только похожие химические связи, но и делать однозначный выбор между молекулами изомеров, отличающихся друг от друга лишь как предмет и его отражение в зеркале. Эта стереоспецифичность ферментного катализа дает возможность получать чистые зеркальные изомеры, обладающие различным физиологическим действием. Например, для получения некоторых психотропных препаратов необходим один из зеркальных изомеров 3-хлор-2-метилпропанола, но в результате химического синтеза образуется сложный эфир, представляющий собой смесь равных количеств «левых» и «правых» молекул, но если этот эфир гидролизировать при помощи фермента липазы, то эфирная связь расщепляется только у «левых» молекул и продукт легко отделяется от исходного вещества. Подобный метод применяется и в других аналогичных случаях, например, для получения зеркальных изомеров аминокислот.
Классификация ферментов:
Согласно международной классификации все ферменты делятся на 6 классов в зависимости от их функционального назначесния в биологических средах.
а) Оксиредуктазы (окислительно-восстановительные ферменты) содержаться во всех живых клетках. Их важнейшая функция заключается в обеспечении энергией (в форме АТФ) всех тканей в реакциях окислительного фосфорилирования (цикл Кребса). Процессы окислительного фосфорилирования протекают с участием кислорода, а исходным материалом для синтеза АТФ являются преимущественно глюкоза и жирные кислоты. Из одной молекулы глюкозы, через ряд превращений в цикле трикарбоновых кислот образуется 38 молекул АТФ; из одной молекулы жирной кислоты образуется 129 молекул АТФ. Оксиредуктазы участвуют и в другом цикле синтеза АТФ – гликолизе, протекающем в цитоплазме. Гликолиз осуществляется в анаэробных условиях и его дебит АТФ значительно ниже – 2 молекулы АТФ из одной молекулы глюкозы.
Аккумулированная в АТФ энергия используется тканями (клетками) практически во всех биохимических реакциях. В эту группу входят более 200 ферментов.
б) Трансферазы. Этот класс ферментов осуществляет перенос различных групп атомов от молекулы одного вещества на молекулу другого. С участием трансфераз обеспечивается биосинтез белков, нуклеиновых кислот и др. Известно более 450 ферментов трансферазной активности.
в) Гидролазы. Класс ферментов, катализирующих реакции гидролиза – расщепления в одной среде высокомолекулярных органических соединений до более простых их составляющих. Гидролазы широко распространены в растительном и животном мире. С их помощью в лизосомах клеток осуществляется гидролиз белков, жиров, сахаров, нуклеиновых кислот. Известно более 200 ферментов этого класса.
г) Лиазы. Группа ферментов, катализирующих отщепление определенных групп атомов с образованием двойных связей. Участвуют в процессах брожения, гликолиза, в цикле трикарбоновых кислот Кребса, в образовании мочевины и т.д. Лиазы широко распространены в природе. Известно около 100 ферментов этого класса.
д) Изомеразы. Природные полимеры обладают способностью вращать ось поляризованного света вправо и влево, что определяется зеркальным пространственным расположением атомов в молекуле. Это явление известно как энантиометрия, или оптическая изомерия. Смесь лево- и правовращающих изомеров называется рацематом. Организмом усваиваются только правовращающие (D - формы) сахара и левовращающие (L - формы) аминокислоты. С помощью ферментов класса изомераз (рацемазы, эпимеразы) осуществляются химическая перестройка молекул и превращение D – форм изомеров в L- формы и наоборот. Изомеразы широко распространены в природе, отличаются высокой специфичностью реакции. Известно более 500 ферментов этого класса.
е) Лигазы (синтетазы). Класс ферментов, катализирующих реакции присоединения друг к другу различных молекул с образованием связей C – O, C – S, C – C, C – N. Эти реакции протекают с участием АТФ и играют важную роль в биосинтезе белков, углеводов, липидов. Широко распространены в природе. Известно более 100 ферментов этого класса.