Занятие 5

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Методы иммобилизации ферментов и целых клеток.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучение основных методов иммобилизации ферментов и клеток. Рассмотрение основных сфер применения иммобилизованных ферментов.

Вопросы, выносимые на семинар:

1. Введите понятие «иммобилизованный фермент».

2. Перечислите основные способы иммобилизации ферментов.

3. Охарактеризуйте требования, предъявляемые к промышленным методам получения иммобилизованных ферментов.

4. Укажите технические и экономические преимущества иммобилизованных ферментов по сравнению с растворимыми ферментами.

5. Охарактеризуйте особенности иммобилизации ферментов за счет образования ковалентных связей между ферментом и носителем.

6. Укажите особенности иммобилизации ферментов методом адсорбции.

7. Поясните сущность иммобилизации ферментов путем включения в структуру геля. Введите понятие «гель». Рассмотрите возможность включения ферментов в полиакриламидный гель.

8. Охарактеризуйте особенности иммобилизации ферментов методом микрокапсулирования. Поясните преимущества микрокапсулированных ферментов. Укажите направления применения микрокапсулированных ферментов

9. Охарактеризуйте особенности иммобилизации ферментов путем их включения в волокна.

10. Охарактеризуйте особенности иммобилизации ферментов путем их включения в липосомы

11. Укажите основные сферы применения иммобилизованных ферментов. Поясните возможности использования иммобилизованных ферментов при производстве полусинтетических β-лактамных антибиотиков. Охарактеризуйте трудности химического синтеза 6-аминопенициллиновой кислоты.

12. Рассмотрите особенности использования иммобилизованных ферментов для разделения рацематов аминокислот. Введите понятие «энантиомер».

13. Поясните возможности применения иммобилизованных ферментов в области лечебного питания (удаление лактозы из молока и получение глюкозы с помощью иммобилизованной лактозы, превращение глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы).

14. Охарактеризуйте области применения ферментных электродов на основе иммобилизованных ферментов. Поясните структуру ферментных электродов и преимущества их практического использования. Укажите особенности применения ферментных электродов, изготовленных на основе иммобилизованной глюкооксидазой.

15. Охарактеризуйте возможности применения перевязочных средств с иммобилизованными ферментами.

16. Поясните возможности иммобилизации целых клеток растений и микроорганизмов. Укажите преимущества иммобилизованных клеток по сравнению со свободноживущими клетками.

Задание 1: Изучить учебный материал.

Учебный материал.

Строгая избирательность действия, сочетающаяся с высокой эффективностью, стойкостью и длительностью действия характерна для препаратов иммобилизованных ферментов. В фармации иммобилизованные ферменты находят широкое применение для получения различных лекарственных средств.

Идея иммобилизации ферментов не нова, так еще в 1916 г. английские химики Нельсон и Гриффин установили, что адсорбированная на алюмогеле инвертаза сохраняет свою активность.

Однако широкие масштабы исследования по иммобилизации ферментов относится к концу 60-70-х гг., когда назрела потребность в разработке новых технологических ферментных катализаторов.

Гетерогенные катализаторы обладают по сравнению с гомогенными рядом преимуществ.

Они легко отделяются от реакционной среды, что позволяет их многократно использовать и получать продукты, незагрязненные ферментами; позволяют вести процесс непрерывно, что, как правило, с технологической и экономической точки зрения значительно выгоднее, чем проведение периодического процесса.

Но есть и свои особенности при иммобилизации ферментов: носитель может оказывать сильное влияние на стабильность и активность иммобилизованного фермента.

В настоящее время стоимость ферментов по-прежнему высока, поэтому в промышленности для их стабилизации и многократного использования могут оказаться пригодными те же самые рациональные методы, что и в живой клетке: с этой целью ферменты стали связывать с искусственными веществами-носителями и мембранами, заключать в гель. Такие связанные ферменты становятся неподвижными и называются иммобилизованными или фиксированными на носителе.

Иммобилизация – ограничение подвижности молекул ферментов, их конформационных построек, которая основана на физико-химических принципах, позволяющих закрепить структуру фермента таким образом, чтобы активный центр его молекулы сохранял свою работоспособность (каталитическую активность) в течение длительного времени, не подвергаясь структурным изменениям, приводящим к нарушению его конфигурации.

Как уже отмечалось выше иммобилизованные ферменты можно использовать многократно. Благодаря связыванию с крупными молекулами носителей удается с помощью простых механических операций (например,, фильтрования) выделять ферменты из реакционной среды.

Разработаны различные методы иммобилизации. Ферменты могут связываться с носителем химически (ковалентно), а также физически – путем адсорбции или путем закрепления на носителе за счет электростатических сил взаимодействия. Под действием специальных реагентов молекулы ферментов могут соединяться между собой (образуя «сеть»). Их удается также механически заключать в гели или микрокапсулы. Путем иммобилизации можно повлиять на характерные свойства того или иного фермента, например на его активность, оптимальную рабочую температуру, оптимальное значение рН, способность связываться с субстратом.

Промышленные методы получения иммобилизованных ферментов должны быть простыми и относительно дешевыми, а получаемые иммобилизованные ферменты должны иметь высокую удельную активность и обладать большой стабильностью при функционировании.

Таким образом, технологические и экономические преимущества иммобилизованных ферментов по сравнению с растворимыми ферментами следующие:

Иммобилизованные ферменты можно использовать многократно, направленно менять их физические и химические свойства. Часто они стабильны в более широком интервале рН и при более высоких температурах, чем растворимые ферменты. Кроме того, конечные продукты процессов не содержат ферментов.

Однако, не смотря на эти преимущества, внедрение иммобилизованных ферментов в промышленности шло не очень быстрыми темпами, причина этого заключалась в том, что многие проекты начали разрабатываться без тщательного предварительного изучения потребностей уже существующего промышленного производства, а также спроса и предложения рынка. Если, например, для получения какого-то определенного вещества промышленность уже выпускала в товарном количестве достаточно дешевые растворимые ферменты, то новые технологии с использованием иммобилизованных ферментов заранее были обречены на неудачу, но все же новые открывающиеся возможности успешного применения иммобилизованных ферментов благодаря таким их свойствам, как активность и стабильность, позволяют предположить перспективность развития данного направления инженерной энзимологии.

Рассмотрим основные способы иммобилизации ферментов.

1. Иммобилизация за счет образования ковалентных связей между ферментом и носителем.

Ковалентная иммобилизация – наиболее надежный способ гетерогенезации (удержания фермента на носителе).

В настоящее время налажен промышленный выпуск носителей для ковалентной иммобилизации. Недостатком такого способа иммобилизации ферментов является существенное возрастание стоимости ферментного катализатора.

Фермент и полимер (матрица) связываются ковалентной связью: матрицу при данном способе иммобилизации фермента обычно предварительно активируют, обрабатывая, например, бромцианом, азотистой кислотой и т.п., благодаря чему она становится носителем активных группировок, которые в свою очередь способны вступать в реакцию взаимодействия с группами NH₂-, -ОН, -СООН.

При ковалентной иммобилизации молекула фермента обволакивается макромолекулой полимера в результате образования между ними 6 - 10 ковалентных связей. Многоточечное взаимодействие фермента с носителем делает его конформацию более жесткой и менее подвижной, за счет этого идет, например, увеличение стабильности к термоденатурации. Фермент оказывается заключенным в полимерную оболочку, имеющую вид петель и достаточно хорошо проницаемую для высокомолекулярных субстратов. Такие соединения получили название «открытые» макромолекулярные капсулы.

В настоящее время в качестве высокомолекулярных матриц использовано достаточно большое количество природных и синтетических полимеров самой разнообразной природы. Наиболее перспективным в смысле сохранения каталитической активности фермента, низкой токсичности и биосовместимости оказались полисахариды (декстрины, альгинаты, пектины), синтетические полимеры на основе винилпирролидона, полиэтиленгликоля и др.

Водорастворимые полимерные производные ферментов характеризуются повышенной стабильностью по отношению к нагреванию и тканевым ингибиторам, увеличенным временем циркуляции в кровотоке, что обуславливает пролонгирование их действия в организме, оказывает менее выраженное побочное действие по сравнению с нативными ферментами, снижением антигенных, иммуногенных и аллергических свойств. Эти преимущества иммобилизованных ферментов открывают широкие перспективы для их клинического использования.

Определенные успехи в этом направлении достигнуты при применении в клинике иммобилизованных протеаз в качестве фибринолитических и противовоспалительных препаратов. Особое значение в этой связи имеют разработка и внедрение в клинику стрептодеказы.