Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

Во всех случаях применения одноволнового однокомпонентного анализа необходимо, чтобы остальные компоненты препарата не оказывали существенного влияния на результаты. Обычно доля их суммарного поглощения в оптическом поглощении образца при АДВ не должна превышать десятой части допусков содержания анализируемого компонента.

2. Многокомпонентный спектрофотометрический анализ.

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ применяют для одновременного количественного определения компонентов лекарственных средств.

Вобычной спектрофотометрии погрешность собственно спектрофотометрических измерений (“спектрофотометрическая погрешность”) мало зависит от типа анализируемого вещества и выбора аналитической длины волны, а определяется классом спектрофотометра и не превышает обычно 0.5%. С учетом погрешностей приготовления растворов, это приводит к суммарной погрешности анализа, не превышающей обычно 1%.

Вотличие от обычной спектрофотометрии, спектрофотометрическая погрешность многокомпонентного анализа определяется не только классом прибора, но и сильно зависит от состава анализируемого лекарственного средства

иособенно выбора аналитических длин волн. Эта погрешность может быть охарактеризована коэффициентом усиления К, который показывает, во сколько раз спектрофотометрическая погрешность определения данного вещества в анализируемой смеси с помощью многокомпонентной спектрофотометрии превышает спектрофотометрическую погрешность определения этого же вещества в чистом растворе (без других компонентов) методом обычной спектрофотометрии. Способы расчета коэффициентов усиления для каждого компонента при использовании различных методов представлены ниже.

Обычными являются величины К=5-10, но возможны и значения К=100 и более, что может приводить к общей погрешности анализа, составляющей десятки

идаже сотни процентов.

Для получения надежных результатов при количественном определении лекарственных средств коэффициенты усиления К не должны обычно превышать 5.

Поэтому прогноз погрешности определения и сравнение ее с допусками содержания анализируемого компонента является обязательным условием при обосновании применимости методик многокомпонентной спектрофотометрии. Если нет соответствующего обоснования, то должно выдерживаться следующее соотношение между полной относительной погрешностью количественного определения ki компонента анализируемого образца ( k,r%) и допусками (+В) содержания этого компонента в образце:

где:

спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:

m

Ai = åEij × c j , i=1…n, (5)

i=1

концентрации) j-ого компонента образца при i-ой аналитической длине волны; ci – концентрация j-ого компонента образца.

Для решения данного уравнения могут применяться различные подходы, среди которых можно выделить три основных: метод наименьших квадратов (МНК), модифицированный метод наименьших квадратов (ММНК) и метод отношения рассчитанных концентраций (МОРК).

Метод наименьших квадратов. Метод наименьших квадратов (МНК) является обобщением метода показателя поглощения одноволнового однокомпонентного анализа. В рамках МНК решение уравнения (3) имеет вид:

Т– символ транспонирования.

Выбор аналитических длин волн (АДВ). Выбор АДВ описан в разделе

«Модифицированный метод наименьших квадратов».

Прогноз погрешности определения. Полная погрешность количественного определения ki компонента с помощью МНК определяется из соотношения:

где:

Sck,r – относительное стандартное отклонение полной погрешности количественного определения k-ого компонента образца;

Aist - оптическая плотность раствора модельной смеси образца, содержащей номинальные концентрации всех компонентов;

Ckst – номинальная концентрация k-ого компонента образца в модельной

смеси;

S A,r – относительное стандартное отклонение сходимости оптической плотности на спектрофотометре (включая кюветную погрешность);

SE,r – относительное стандартное отклонение правильности оптической плотности на спектрофотометре;

SV ,r – относительное стандартное отклонение погрешности приготовления растворов.

В случае анализа двух соединений по двум длинам волн, АДВ можно находить из условия максимума информационных коэффициентов каждого компонента при одной из двух длин волн.

Схема проведения анализа. Готовят модельную смесь, содержащую все компоненты препарата точно в номинальных концентрациях (раствор сравнения). Проводят необходимые разбавления, измеряют попеременно оптические плотности испытуемого раствора и раствора сравнения при АДВ и проводят расчет по уравнениям (10-11).

Прогноз погрешности определения. Полную погрешность количественного определения ki компонента с помощью ММНК определяют из соотношения:

Sck2 ,r = 2 ×[(KkMMHK )2 × SA2,r + SV2,r ] (15)

Должно выполняться соотношение (3).

Недостатком ММНК является необходимость приготовления точной номинальной смеси образца, однако он является самым надежным и точным из всех многоволновых методов количественного определения лекарственных средств.

Частный случай – количественное определение одного компонента смеси по одной длине волны. Если информационный коэффициент (r,k) ki компонента при i-ой длине волны значительно превосходит все остальные, то количественное определение этого компонента можно проводить по упрощенной формуле:

X k = di (16)

Максимальная погрешность такого приближенияне превосходит 2В(1- r,k). Данное приближение является обоснованным при r,k ≥ 0.95.

Метод отношения рассчитанных концентраций. Метод отношения рассчитанных концентраций (МОРК) является одним из вариантов обобщения метода стандарта на случай многокомпонентной спектрофотометрии и основан на допущении, что отношение концентраций, рассчитанных для испытуемого раствора и раствора сравнения, является более точным, чем сами рассчитанные концентрации, то есть:

i=1

Здесь aki – коэффициенты расчетной матрицы, полученные с помощью МНК (уравнение (7)) или другими методами цифровой фильтрации, например, методом производной спектрофотометрии. В отсутствии фона поглощения самым точным является применение МНК.

Выбор аналитических длин волн (АДВ). Смотрите выбор АДВ и ММНК. Процедура проведения анализа. Такая же как для ММНК, но для

изготовления модельной смеси можно использовать концентрации компонентов, близкие (а не точно равные) к номинальным. Расчет концентраций проводят по уравнению (17).

Прогноз погрешности определения (в случае использования МНК) проводят по соотношению:

Sck2 ,r = 2 ×[(KkMHK )2 × SA2,r + SV2,r ] (18)

Должно выполняться соотношение (3).

МОРК менее точен, чем ММНК, но он не требует приготовления точно номинальной смеси и поэтому проще в применении.

# ПРОИЗВОДНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

Производную спектрофотометрию используют для количественного определения обычно в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное присутствием веществ, содержание которых не регламентируется. Она может применяться в двух вариантах.

В первом случае получение производной проводит сам аналитик с помощью производных полиномов, которые представляются в уравнении (17) вместо величин aki. Прогноз погрешности концентрации должен учитывать в этом случае погрешность неполного обращения в нуль поглощения других компонентов смеси.

Во втором случае непосредственно используют значения производных, получаемых на спектрофотометре. Процедура анализа при этом аналогична применению метода стандарта в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют производные.

2.2.26.БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

#Хроматография на бумаге представляет собой хроматографический метод разделения, при котором подвижная жидкая фаза перемещается по капиллярам и поверхности фильтровальной бумаги, либо веществ, предварительно нанесенных на ее волокна. В бумажной хроматографии используют хроматографическую бумагу нужной плотности квалификации «Для хроматографии».

ВОСХОДЯЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ

Оборудование. Представляет собой стеклянную камеру с тщательно пришлифованной крышкой, соответствующую по размерам используемой хроматографической бумаге. Камера в верхней части должна быть снабжена приспособлением для закрепления хроматографической бумаги, с помощью которого ее можно опускать не открывая камеры. На дне камеры помещена емкость (лодочка) для подвижной фазы, в которую должен быть погружен нижний край бумаги. Хроматографическая бумага представляет собой соответствующую фильтровальную бумагу, разрезанную на полоски достаточной длины и шириной не менее 2,5 см; бумага должна быть разрезана так, чтобы подвижная фаза двигалась вдоль направления волокна бумаги.

# В некоторых случаях допускается использование хроматографических камер других типов с описанием их в частной статье.

Методика. Обозначенную в частной статье подвижную фазу помещают в лодочку в количестве, достаточном для образования слоя не более 2.5 см. Как указано в частной статье, между стенками камеры и лодочки помещают хроматографическую бумагу. Для насыщения камеру закрывают крышкой и выдерживают обычно 24 часа при температуре от 20оС до 25оС. Поддерживают такую температуру камеры на протяжении всего испытания.

На расстоянии 3 см от одного края по всей ширине полоски бумаги карандашом наносят тонкую горизонтальную линию. Обозначенный в частной статье объем раствора наносят на полученную линию при помощи микропипетки. Если весь обозначенный раствор образует пятно диаметром более 10 мм, раствор наносят небольшими порциями, давая каждому из них высухнуть перед нанесением следующего. Если на одной полоске бумаги должно быть получено больше одной

хроматограммы, растворы наносят вдоль линии так, чтобы расстояние между точками нанесения частных проб было не менее 3 см.

# Если условия насыщения хроматографической камеры, нанесения пятен или хроматографирования отличаются от условий, описанных выше, они должны быть описаны в частной статье.

Бумагу помещают в камеру, закрывают камеру крышкой и выдерживают 1.5 часа. Бумагу опускают в подвижную фазу и проводят элюирование в соответствии с указанным временем или на указанное растояние, которое должна пройти подвижная фаза. На протяжении всего процесса элюирования бумагу защищают от воздействия прямых солнечных лучей. Полоску бумаги вынимают из камеры и сушат на воздухе.

#После прохождения подвижной фазы необходимого расстояния, обозначенного в частной статье, бумагу вынимают, отмечают карандашом конец положения фронта подвижной фазы, сушат и проявляют пятна обозначенным в частной статье способом.

#Визуальную оценку, количественное определение, проверку пригодности хроматографической системы, способы оценки определения примесей, контроль специфических примесей, контроль общего содержания примесей проводят в соответствии со статьей 2.2.27 «Тонкослойная хроматография».

НИСХОДЯЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ

Оборудование. Представляет собой стеклянную камеру с тщательно пришлифованной крышкой, соответствующую по размерам используемой хроматографической бумаге. В центре крышки должно быть отверстие с диаметром около 1,5 см, закрытое тяжелой стеклянной пластиной или пробкой. В верхней части камеры располагается лодочка для подвижной фазы, снабженная приспособлением для закрепления хроматографической бумаги. От каждой стороны лодочки параллельно ей и немного выше верхнего ее края размещены два прямых стеклянных стержня, которые поддерживают бумагу в таком положении, чтобы она не соприкасалась со стенками камеры. Хроматографическая бумага представляет собой соответствующую фильтровальную бумагу, разрезанную на полоски достаточной длины и шириной не менее 2,5 см и не более длины кюветы; бумага должна быть разрезана таким образом, чтобы подвижная фаза двигалась вдоль направления волокна бумаги.

# В необходимых случаях допускается использование хроматографических камер других типов с описанием их в частной статье.

Методика. Обозначенную в частной статье подвижную фазу помещают в лодочку в количестве, достаточном для образования слоя не более 2,5 см. Для насыщения камеру закрывают крышкой и выдерживают обычно 24 часа при температуре от 20оС до 25оС. Поддерживают такую температуру камеры на протяжении всего испытания.

По всей ширине полоски бумаги карандашом наносят тонкую горизонтальную линию от закрепленного в лодочке края на таком растоянии, чтобы линия была размещена параллельно стеклянным стержням и несколькими сантиметрами ниже их. Обозначенный в частной статье объем раствора наносят на полученную линию при помощи микропипетки. Если весь обозначенный раствор образует пятно диаметром более 10 мм, раствор наносят небольшими порциями, давая каждому из них высохнуть перед нанесением следующего. Если на одной полоске бумаги должно быть получено больше одной хроматограммы, растворы наносят вдоль линии так, чтобы расстояние между точками нанесения частных проб было не менее 3 см.

#Если условия насыщения хроматографической камеры, нанесения пятен или хроматографирования отличаются от условий, описанных выше, они должны быть описаны в частной статье.

Бумагу помещают в камеру, закрывают камеру крышкой и выдерживают 1,5 часа. Через отверстие в крышке в кювету помещают достаточное количество подвижной фазы и проводят элюирование в соответствии с указанным временем

или на указанное растояние, которое должна пройти подвижная фаза. На протяжении всего процесса элюирования бумагу защищают от воздействия прямых солнечных лучей.

#После прохождения подвижной фазой необходимого расстояния, обозначенного в частной статье, бумагу вынимают, отмечают карандашом конец

положения фронта подвижной фазы, сушат и проявляют пятна обозначенным в частной статье способом.

# Визуальную оценку, количественное определение, проверку пригодности хроматографической системы, способы оценки определения примесей, контроль специфических примесей, контроль общего содержания примесей проводят в соответствии со статьей 2.2.27 «Тонкослойная хроматография».

2.2.27. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой метод разделения, в котором используется неподвижная фаза, состоящая из подходящего материала, нанесенного в виде тонкого слоя и зафиксированного на подложке (пластинке) из стекла, металла или пластмассы. Перед хроматографированием растворы анализируемых веществ наносят на пластинку. Разделение основано на процессах адсорбции, распределения, ионного обмена или на их комбинации и осуществляется посредством перемещения в тонком слое (неподвижной фазе) исследуемых веществ, растворенных в растворителе или соответствующей смеси растворителей (подвижной фазе).

ОБОРУДОВАНИЕ

Пластинки. Хроматографирование проводят с использованием пластинок, полученных, как указано в разделе «Реактивы».

#Допускается использование пластинок, приготовленных в промышленных условиях, если они отвечают требованиям раздела 4.1.1. «Реактивы», а также выдерживают испытание «Проверка пригодности хроматографической системы», описанное в частной статье. Рекомендуется каждую партию получаемых пластинок, приготовленных в промышленных условиях, проверять на близость величин Rf.

#Близость величин Rf. Испытания проводят не менее чем на трех пластинках испытуемой партии. Для этого используют методику проверки хроматографической разделяющей способности, указанной в разделе 4.1.1. «Реактивы» («ТСХ пластинка с слоем силикагеля»). На линию старта каждой пластинки наносят по 5 пятен раствора для проверки пригодности ТСХ пластинок

Р, хроматографируют и рассчитывают величины Rf красителей для каждого нанесения. В пределах каждой пластинки наибольшая разница величин Rf среди разных нанесений для каждого красителя не должна превышать 0.02. В противном случае такие пластинки не рекомендуется использовать для фармакопейного анализа.

Предварительная подготовка пластинок. В некоторых случаях может понадобиться промывка пластинок перед хроматографированием, которая может быть выполнена посредством предварительного элюирования чистых пластинок подходящим растворителем. Пластинки могут быть также импрегнированы (пропитаны) посредством таких процедур, как элюирование, погружение или

опрыскивание. Перед использованием пластинки активируют, если необходимо, посредством нагревания в термостате при температуре от 100оС до 105оС в течение 1 часа.

#Допускаются другие условия активации пластинок, описанные в частных

статьях.

Хроматографическая камера представляет собой емкость с плотно подогнанной крышкой и с плоским дном или дном с двумя желобами из инертного прозрачного материала, соответствующими по размеру используемым пластинкам. Для горизонтального элюирования хроматографическая камера имеет желоб для подвижной фазы и дополнительно содержит устройство для подачи подвижной фазы к неподвижной фазе.

#В необходимых условиях допускается использование хроматографических камер других типов с описанием их в частных статьях.

Микропипетки, микрошприцы, калиброванные капилляры или другие устройства, пригодные для нанесения растворов.

Устройство для обнаружения или тушения флуоресценции.

Проявляющие реактивы – для обнаружения разделенных веществ посредством опрыскивания, обработки парами или погружения.

МЕТОДИКА

#Если нет других указаний в частной статье, хроматографическое разделение выполняют восходящим способом в насыщенной атмосфере.

#Предпочтительнее использовать такие подвижные фазы, которые

обеспечивают величины Rf испытуемых соединений в пределах от 0,3 до 0,7. Вертикальное элюирование. Стенки хроматографической камеры

выстилают фильтровальной бумагой. Подвижную фазу наливают в камеру в количестве, достаточном для того, чтобы после смачивания фильтровальной бумаги покрыть дно камеры слоем жидкости, необходимым для хроматографирования. Для насыщения хроматографическую камеру с подвижной

фазой закрывают крышкой и выдерживают в течение 1 часа при температуре от

20оС до 25оС.

#Слой жидкости в хроматографической камере должен быть таким, чтобы после помещения в него пластинки пятна или полосы находились над уровнем жидкости.

Объемы растворов анализируемых веществ, указанные в частной статье, наносят небольшими порциями, получая полосы или круглые пятна на подходящем расстоянии от нижнего края и от боковых краев пластинки. Растворы наносят на линию, параллельную нижнему краю пластинки, с расстоянием не менее 10 мм между пробами.

#Если нет других указаний в частной статье, пятна или полосы наносят на расстоянии не менее 15 мм от нижнего края и не менее 10 мм от боковых краев пластинки.

После испарения растворителей из нанесенных проб пластинку помещают в хроматографическую камеру как можно более вертикально, следя за тем, чтобы

пятна или полосы находились выше поверхности подвижной фазы. Камеру закрывают, оставляют ее при температуре от 20оС до 25оС в защищенном от прямых солнечных лучей месте. После того как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной статье, пластнику вынимают, сушат и обнаруживают пятна способом, указанным в частной статье.

В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальное элюирование. Объемы растворов анализируемых веществ, указанные в частной статье, наносят небольшими порциями, получая круглые пятна (от 1 мм до 2 мм в диаметре) или полосы (длиной от 5 мм до 10 мм и шириной от 1 мм до 2 мм) на подходящем расстоянии от нижнего края и от боковых краев пластинки (# если нет других указаний в частной статье, пятна или полосы наносят на расстоянии не менее 15 мм от нижнего края и не менее 10 мм от боковых краев пластинки). Растворы наносят на линию, параллельную нижнему краю пластинки, с интервалом не менее 5 мм между нанесенными пробами.

После испарения растворителей из нанесенных проб в желоб хроматографической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное количество подвижной фазы, помещают пластинку горизонтально в хроматографическую камеру и подсоединяют устройство для подачи подвижной фазы в соответствии с инструкцией производителя. Если указано в частной статье,

пластинку элюируют, начиная одновременно с двух концов. Камеру закрывают и проводят хроматографирование при температуре от 20оС до 25оС. После того, как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна указанным способом.

В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном первому.

ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА

Идентификация. Основное пятно на хроматограмме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном на хроматограмме, полученной для раствора стандартного образца (раствора сравнения), сравнивая окраску (цвет флуоресценции), размер и величину удерживания (Rf) обоих пятен.

Величину удерживания (Rf) определяют как отношение расстояния от точки нанесения пятна до центра кромки пятна после хроматографирования к расстоянию, пройденному фронтом растворителя от точки нанесения.

Проверка разделяющей способности неподвижной фазы для идентификации. Обычно для оценки пригодности достаточно испытания на пригодность неподвижной фазы, описанного в разделе «Реактивы». В особых случаях дополнительные требования указывают в частных статьях.

Испытание на сопутствующие примеси. Дополнительное пятно (пятна) на хроматограмме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном (пятнами) на хроматограмме, полученной для раствора сравнения. В качестве стандартного образца для приготовления раствора сравнения используют как саму примесь (примеси), так и различные разбавления испытуемого раствора.

Проверка разделяющей способности. Требования для проверки разделяющей способности приводят в соответствующих частных статьях.

Проверка чувствительности. Чувствительность считается удовлетворительной, если пятно или полоса четко обнаруживаются на хроматограмме, полученной с наиболее разбавленным раствором сравнения.

# Проверка пригодности хроматографической системы. Результаты анализа методом тонкослойной хроматографии считаются достоверными, если выполняются требования испытания «Проверка пригодности хроматографической системы».

Хроматографическая система считается пригодной если:

-на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки пригодности хроматографической системы, четко разделяются пятна указанных в частной статье веществ;

-величина Rf основного пятна на хроматограмме испытуемого раствора должна быть близка, указанной в частной статье;

-на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки чувствительности хроматографической системы, должно быть четко видно пятно.

#СПОСОБЫ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ПРИМЕСЕЙ МЕТОДОМ ТСХ

При контроле примесей нежелательно включение в частную статью требования отсутствия пятна контролируемой примеси на хроматограмме испытуемого раствора.

Методом ТСХ могут контролироваться как конкретно указываемые (специфические) примеси, так и общее содержание примесей.

Контроль специфических примесей. Контроль специфических примесей применяют в тех случаях, когда содержание каких-то конкретных примесей, возникающих в процессе производства лекарственного средства или его хранения, должно быть ограничено ввиду их токсичности или по другим соображениям.

При контроле специфических примесей обычно используют сравнение пятен регламентированных примесей на хроматограммах испытуемого раствора и раствора сравнения.

Контроль общего содержания примесей. В тех случаях, когда нет оснований считать какие-то примеси особо токсичными, часто не так важно знать их

истинное содержание. Важно знать, что это содержание не превосходит определенного уровня. В таких случаях используют метод внутренней нормализации – в качестве растворов сравнения обычно используют растворы самой испытуемой субстанции различной концентрации, а содержание примесей находят в пересчете на эту субстанцию.

Взависимости от количества различных растворов субстанции, наносимых на хроматограмму в виде растворов сравнения, контроль общего содержания примесей может быть одноуровневым, двухуровневым и трехуровневым.

Вдвух- и трехуровневом вариантах возможна регламентация и общей

суммы примесей.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ

Требования к разрешению и разделению приводят в частных статьях.

В том случае, когда вещества, разделяемые методом тонкослойной хроматографии, поглощают или флуоресцируют в ультрафиолетовом или видимом свете, их можно количественно определить непосредственно на пластинке, используя подходящее оборудование. Для этого измеряют отражение или пропускание падающего света, передвигая пластинку или измеряющее устройство. Аналогичным образом, используя подходящее оптическое оборудование, можно измерять флуоресценцию. Вещества, содержащие радионуклиды, могут быть количественно определены тремя способами:

-непосредственно на пластинке – передвижением пластинки вдоль подходящего счетчика радиоактивности или счетчика радиоактивности вдоль пластины («Радиофармацевтические препараты»);

-разрезанием пластинки на полосы и измерением радиоактивности на каждой полосе, используя подходящий счетчик радиоактивности;

-соскребанием неподвижной фазы, растворением ее в подходящем сцинтилляционном коктейле и измерением радиоактивности с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Оборудование. Оборудование для измерений непосредственно на пластинке включает в себя:

-устройство для прямого нанесения в определенном месте пластинки необходимого количества вещества;

-механическое устройство для передвижения пластинки или измерительного устройства вдоль осей Х или У;

-самописец и интегратор или компьютер;

-для веществ, поглощающих или флуоресцирующих в ультрафиолетовом или видимом свете: для измерения отражения или пропускания используются фотометр с источником света, оптическое устройство, генерирующее монохроматический свет, и фотоячейку соответствующей чувствительности; в том случае, когда измеряется флуоресценция, требуюется дополнительно монохроматический фильтр для выбора соответствующей спектральной области излучаемого света;

-для веществ, содержащих радионуклиды: подходящий счетчик радиоактивности; для него необходимо проверить линейный диапазон.

Методика. Готовят способом, указанным в частной статье, раствор

анализируемого вещества (испытуемый раствор) и, если необходимо, растворы стандартных образцов анализируемых веществ в том же растворителе (растворы сравнения). Наносят одинаковый объем каждого раствора на пластинку и хроматографируют.

Для веществ, поглощающих или флуоресцирующих в ультрафиолетовом или видимом свете. Готовят и наносят не менее трех растворов сравнения, концентрации которых охватывают ожидаемое значение концентрации в испытуемом растворе (около 80%, 100% и 120% от этой концентрации). Опрыскивают, если необходимо, указанным реактивом и регистрируют отражение, пропускание или флуоресценцию на хроматограммах, полученных для испытуемого раствора и растворов сравнения. По полученным данным рассчитывают количество вещества в испытуемом растворе.

Для веществ, содержащих радионуклиды. Готовят и наносят испытуемый раствор, содержащий около 100% ожидаемого значения концентрации. Измеряют радиоактивность как функцию длины пути и записывают радиоактивность каждого полученного пика в процентах от суммарной радиоактивности.