3) Классификация генных мутаций. Молекулярные болезни

Существует несколько классификаций мутаций:

1. по локализации повреждения – а) генные, б) хромосомные.

2. Генные мутации по механизму развития – а) точковые – транзиция (замена одного пурина на другой или одного пиримидина на другой) и трансверзия (замена пурина на пиримидин или наоборот); б) инверсия – перестановка нуклеотидов; в)  делеция – выпадение одного или нескольких нуклеотидов; г) вставка – включение одного или нескольких нуклеотидов.

3. По физиологическому проявлению генные мутации можно подразделить на а) молчащие – замена основания не меняет смысла кодона, т.к. код вырожден, например, УУУ кодирует фен и УУЦ также кодирует фен; б) нейтральные – замена аминокислоты на другую, близкую по строению, например, лей на иле и т.п. При этом биологическая активность белка сохраняется; в) патогенные – нарушение аминокислотного состава белка и его биологической активности. Это приводит к молекулярным болезням или к гибели. Г) полезные – происходит синтез белков с новыми свойствами (эти мутации приводят к появлению нового вида).

Роль мутаций. 1) эволюционная – в результате мутаций возникают организмы лучше приспособленные к условиям внешней среды. 2) мутации обуславливают появление гетерогенных молекул, т.е. белков с небольшими различиями в первичной структуре, благодаря чему эти белки способны выполнять одну и ту же функцию в разных условиях. Например, наличие гетерогенных форм гемоглобина помогает плоду приспосабливаться к разному парциальному давлению кислорода в отдельные периоды внутриутробного развития. 3) возникновение патологических мутаций приводит к развитию генетических болезней. Генетические болезни можно разделить на 3 группы – 1) хромосомные болезни; 2) моногенные болезни; 3) мультифакториальные болезни.

Хромосомные болезни развиваются в результате недостатка или избытка  хромосом, выпадения части хромосомы или транслокации (например, синдром Дауна и т.п.). Моногенные, или молекулярные болезни развиваются вследствие поражения одного гена. Они бывают аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные и Х-сцепленные. Кроме этого моногенные болезни делятся на а) ферментные; б) неферментные.

Ферментные молекулярные болезни Связаны с нарушением синтеза или изменением функции какого-либо фермента. В организме нарушается нормальное течение определенных реакций обмена веществ. Например, при гликогенозах отсутствуют ферменты, катализирующие распад гликогена.

Фенилкетонурия – врожденное заболевание, связанное с отсутствием ферментов, ускоряющих образование тир из фен. При этом в крови накапливается фен (в норме этой аминокислоты 0,006мМ/л, при ФКУ уровень достигает 0,02мМ/л и выше). большое количество фен оказывает токсическое действие на нервную ткань, вызывая демиелинизацию волокон.

Галактоземия развивается при отсутствии ферментов, ускоряющих превращение галактозы в организме, приводит к непереносимости молока и молочных продуктов.

Акаталаземия характерна для жителей Японии и связана с накоплением перекиси водорода, который в норме разрушается каталазой. Это заболевание сопровождается снижением сопротивляемости организма, развитием язв на слизистых и коже, раком кожи.

Неферментные молекулярные болезни Связаны с нарушением структур белковых молекул, чаще первичной структуры, что ведет к неспособности белков выполнять характерные для них функции. Например, серповидно-клеточная анемия возникает в результате точковой мутации в бета-цепи гемоглобина, в которой вал заменяется на глу. При этом изменяются физико-химические свойства гемоглобина – он хуже растворяется в воде, в эритроцитах он располагается в виде полумесяца (серпа), эритроциты более подвержены гемолизу.

Лечение молекулярных болезней: 1) исключение из пищи веществ, которые в результате мутации не усваиваются организмом, например, при галактоземии исключают молоко и молочные продукты; при фенилкетонурии исключают продукты, содержащие фенилаланин; 2) диетическое восполнение этих веществ; 3) нейтрализация токсических продуктов, образующихся при мутации; 4) генная терапия (см. таблицу ниже).

Таблица Принципы генной терапии врожденных болезней

Принцип лечения	Болезнь	Лечение (пример)
Замещение недостающего продукта	Семейный зоб	Левотироксин
Ограничение субстрата	Фенилкетонурия	Диета с низким содержанием фенилаланина
Замена мутантного фермента	Болезнь Гаучера	Введение бета-гликозидазы
Замещение недостающего белка	Гемофилия	Введение VIII фактора
Увеличение активности мутантного фермента путем снабжения большим количеством кофермента	Метилмалоновая ацидурия	Введение витамина В12
Увеличение активности мутантного фермента путем индукции	Синдром Криглера-Найяра	Фенобарбитал
Замещение больного органа, несущего дефектный ген	Галактоземия*	Трансплантация печени
Введение белка в соматические клетки путем генной терапии	Многие генетические болезни	Например, у больных с дефицитом аденозиндезаминазы, фиброзом поджелудочной железы, семейной гиперхолестеринемией и т.д.

* Галактоземию в первую очередь лечат путем назначения диеты с низким содержанием лактозы, если болезнь выявлена на ранней стадии

Генная терапия включает в себя замещение гена, его исправление иувеличение (амплификация). В настоящее время возможна генная терапия только на уровне соматических клеток.

При замещении мутантный ген удаляется и заменяется на нормальный. При исправлении только мутантная зона поврежденного гена исправляется. Эти методы пока малодоступны. Замещение  и исправление генов можно отнести к методам генной хирургии.

Увеличение гена включает введение чужого генетического материала в клетку, чтобы компенсировать уровень недостающего продукта мутантного гена. Это единственный метод генной терапии, доступный в настоящее время. Чужеродный материал может быть введен в пораженные клетки разными методами: 1) на культуре клеток (in vitro) — а) внутриядерная инъекция; б) трансфекция (например, с фосфатом кальция); в) электрофорез. 2) в организм больного (in vivo) с помощью – а) специально созданных ретровирусов; б) аденовирусов (используются для введения гена, пораженного при фиброзе поджелудочной железы, при этом аденовирусы вводятся интраназально); в) плазмидно-липосомных комплексов. 3) в эксперименте изучается сайт-направленная рекомбинация.

Генная инженерия — это направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит использование технологии рекомбинантных ДНК. При этом важное значение имеет использование особых ферментов — рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз).

Рестрикционные эндонуклеазы – ферменты, способные вступать в реакцию с определенными участками в ДНК (сайтами узнавания). Эти участки в клетках защищены метильными группами, поэтому рестриктазы присутствуют только в  таких клетках, которые содержат специфические метилазы. Метилазы метилируют  хозяйскую  ДНК и, таким образом, защищают ее от действия рестриктаз. Первая рестриктаза открыта в 60-х годах ХХ-ого века Смитом. После действия фермента одна из цепей ДНК становится длиннее на несколько нуклеотидов. Эти нуклеотиды могут свободно спариваться с другими. Благодаря этому ДНК из различных источников может объединяться, образуя рекомбинантные молекулы.

Гены, контролирующие образование функционально активных белков, теперь можно вводить в бактерии и размножать (амплифицировать). Эта процедура называется клонированием генов. Понятие «клон» определяется как большая  популяция идентичных молекул, бактерий или клеток – потомков одного предка. Благодаря клонированию появилась возможность вырабатывать в больших количествах белки, которые раньше удавалось получить ничтожно мало. Это возможно путем технологии рекомбинантных ДНК – бактерии содержат помимо своих ДНК плазмиды – маленькие кольцевые ДНК. Плазмиды реплицируются автономно и сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ, например, колицинов, убивающие другие бактерии. Плазмиду можно выделить и расщепить с помощью рестриктазы в одном сайте, превратив ее в ДНК с «липкими концами». Фрагменты любой чужеродной ДНК с такими же «липкими концами» (полученными после разрезания аналогичной рестриктазой) можно сшить с плазмидой бактерии с помощью лигазы. Полученную таким образом рекомбинантную ДНК вводят в бактерию, где она реплицируется. Источник чужеродной ДНК не имеет значения. Такая ДНК может быть получена, например, из клеток человека, но можно сшивать и искусственно синтезированные гены. Кроме бактериальных плазмид в качестве носителей (векторов) используют ДНК фагов и космиды.

Благодаря использованию клонированных фрагментов установлена хромосомная локализация многих генетических нарушений, для которых не удавалось выявить недостаточности по каким-либо специфическим белкам. К таким заболеваниях относится хорея Гентингтона (хромосома 4); муковисцедоз (хромосома 7); поликистозная нефропатия взрослых (хромосома 16); мышечная дистрофия Дюшена (хромосома 10). Если область ДНК, в которой локализован дефект, имеет характерную структуру гена, то можно синтезировать этот ген, ввести в соответствующий вектор (плазмиду, например), добиться экспрессии и изучить функцию.

Использование генно-инженерных продуктов в медицине. Путем технологии рекомбинантных ДНК получены: 1) активатор тканевого плазминогена (АТП) – используется для рассасывания тромбов. 2) VIII фактор свертывания – используется при гемофилии. 3) ростовые факторы иммунной системы – для стимуляции лейкоцитарной активности при иммунодефицитах. 4) эритропоэтин – используется для лечения анемии при почечной недостаточности. 5) гормон роста (СТГ) – применяют для лечения карликовости. 6) инсулин – применяют для лечения СД. 7) интерферон – для профилактики вирусных инфекций. моноклональные антитела – используются в диагностических целях, для адресной доставки лекарств, радиоактивных изотопов при лечении рака. 9) вакцины – первой была получена вакцина против гепатита В.