1. 1. Геномика и протеомика

2. 2. Регуляция экспрессии генов

3. 3. Апоптоз

4. 4. Молекулярные болезни и принципы их терапии

Геномика и протеомика

Геномика – это изучение функций генов. Геном человека полностью открыт в 2003 году. У человека он состоит из 3млрд пар оснований. закончено описание всех генов и их распределение по хромосомам. Выяснена роль всех генов. При этом стало ясно, что не все наследственные признаки записаны в ДНК, в геноме записана только информация о структуре белков. Протеомика – это изучение белков – как продуктов определенных генов и роли этих белков. белки – это самообучающиеся молекулы, т.е. в течение жизни они взаимодействуют между собой и это взаимодействие запускает метаболические цепи и процессы. Гены состоят примерно из сотен или даже тысяч пар мононуклеотидов, идентификацию гена осуществляют с помощью цис-транс-теста, поэтому ген иначе называют цистроном. Ген может существовать во многих альтернативных состояниях – множественные аллели. Каждое аллелеморфное состояние представляет определенную конфигурацию гена (аллель – альтернативное состояние гена). Неинформативные участки называются интронами. Предполагается, что интроны играют роль регуляторных сигналов. В ДНК также выявлены подвижные участки – «прыгающие» гены, перемещение которых объясняется механизмами обратной транскрипции. Эти гены играют определенную роль в развитии онкозаболеваний, т.к. встраиваясь рядом с онкогеном, они активируют его. В ДНК имеются повторяющиеся последовательности, которые состоят из 2-6 пар оснований и повторяющиеся до 50 раз (микросателлитные повторяющиеся последовательности). Большинство генов связано с этими последовательностями и это позволяет определить связь гена с определенной болезнью. Нестабильность микросателлитных последовательностей (например, увеличение в них тринуклеотидных последовательностей) может вызывать ту или иную болезнь. Например, нестабильный ЦГГ повтор связан с синдромом Х; ЦАГ – с хореей Гентингтона и спинобульбарной мышечной атрофией; ЦТГ – с миотонической дистрофией.

Т.о., геномика и протеомика позволяют сделать следующие заключения: 1) все болезни наследственно обусловлены, за исключением острых инфекционных и травм. Поэтому можно выделить: а) классические наследственные болезни, например, фенилкетонурию, галактоземию, т.е. болезни, связанные с мутацией в одном гене; б) мультифакториально наследуемые болезни,  когда мутации происходят во многих генах, например, атеросклероз, гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца и т.п. Поэтому современная запись диагноза включает указание какая хромосома и ген в ней поражены при данном заболевании.

2) наступил переломный период человечества, т.е. накоплен значительный мутационный груз, например, 200млн человек являются носителями гемоглобинопатий, 5% — носителями муковисцедоза, 3% — носителями врожденного гипотиреоза, 2-3% — носителями адреногенитального синдрома, 2-3% — носителями семейной гиперхолестеринемии.

Регуляция экспрессии генов

Французские ученые Жакоб и Мано в 1961 году предложили схему регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции. Они установили, что в молекуле ДНК есть участки (транскриптоны, или опероны), где закодировано строение специфических РНК – структурные гены (3% от всех генов) и регуляторные участки (97%). Непосредственно перед структурными генами располагаются регуляторные участки — ген-оператор и промотор. С промотором связывается фермент – РНК-полимераза, «запускающий» транскрипцию. Это возможно только в том случае, если ген-оператор и промотор свободны. Большинство этих участков находится в нерабочем состоянии, «репрессированы», т.к. ген-оператор связан с белком-репрессором (70-80%) и это мешает присоединяться РНК-полимеразе к гену-промотору. Репрессорный белок синтезируется в ядре. Информация об этом белке заложена в гене-регуляторе. Т.о., белок-репрессор останавливает транскрипцию. Когда необходимо начать синтез определенного белка, на ген-регулятор действуют регуляторные агенты – стероиды и др., они блокируют этот ген и белок-репрессор не образуется, а значит транскрипция возможна и необходимый белок синтезируется (репрессорный механизм ).

Существует другой механизм регуляции на уровне транскрипции – индукторный. Ряд веществ (некоторые метаболиты) могут связывать белок-репрессор, тем самым открывая путь для синтеза белка.   Регуляция на уровне транскрипции также связана с гистонами и другими белками, связанными с ДНК. Комплексы белков с ДНК функционально не активны, большинство генов в ДНК подавлены. Предполагается, что около 20-30% генов может синтезировать мРНК. При этом даже активные гены функционируют периодически, по мере изменения потребности клетки. Уменьшить, снять блокирование, можно ослабив связь гистонов с молекулой ДНК путем фосфорилирования, ацетилирования или метилирования, т.к. эти процессы нейтрализуют заряд на гистоне.

В регуляции на уровне транскрипции специфическое участие принимает особый белок – катаболитный генактивирующий белок. Этот белок, взаимодействующий с цАМФ, образует комплекс, способствующий прикреплению РНК-полимеразы к промоторному участку генома. В присутствии комплекса идет транскрипция.

У эукариот также выделены и охарактеризованы 5 регуляторных белков, получивших название транскрипционных факторов (ТF: IIА, IIВ, IID, IIE, IIF). Они необходимы для узнавания участка ДНК, названного ТАТА. Ацетилирование гистонов приводит к нарушению нуклеосомы и открывает доступ для транскрипционных факторов к ДНК. Деацетилирование гистонов приводит к обратному эффекту. Метилирование дезоксицитидиновых остатков в ДНК прекращает транскрипцию.

Более подробно изучена группа белков-активаторов транскрипции. Они активируют транскрипцию не прямо, а опосредованно – через промежуточные белки, названные коактиваторами.

Регуляция на уровне трансляции

Важное значение имеет обеспеченность клетки аминокислотами, особенно незаменимыми. При недостатке какой-либо аминокислоты задерживается образование соответствующей аминоацилтРНК, что ведет к торможению трансляции.

Известны различные ингибиторы белкового синтеза, действующие либо на сами м-РНК, либо на процессы инициации, элонгации или терминации. Например, антибиотик пуромицин останавливает элонгацию пептидной цепи. Он обладает сходством с аминоацилтРНК и связывается с синтезирующимся пептидом. Но пуромицин не имеет петлю антикодон, вследствии этого не может соединяться с мРНК и взаимодействовать с новой аминоацилтРНК. Образовавшийся пептидилпуромицин отделяется от рибосомы и синтез белка прекращается. На уровне трансляции действуют и другие антибиотики – тетрациклин, левомицетин, стрептомицин и др.

Антибиотики могут влиять не только на трансляцию, например, имеются антибиотики, препятствующие разделению цепей ДНК (метамицин); антибиотики, прекращающие  транскрипцию (актиномицин, канамицин).

Имеются антибиотики, тормозящие синтез РНК. Одним из мощных ингибиторов синтеза вирусной РНК является азидотимидин, синтезированный в 1964 году. Оказалось, что вирусная обратная транскриптаза иммунодефицита человека оказалась наделена большим сродством к азидотимидину, чем к дТТФ. Таким образом, азидотимидин конкурентно тормозит связывание дТТФ, вызывая окончание синтеза вирусной РНК.

Регуляция на уровне генов

В настоящее время открыты гены, активирующие пролиферацию, или онкогены (myс, new, ras, cabl, bcl-2). Онкогены – это гены, способные вызвать рак. Их открытие позволило глубже понять механизмы канцерогенеза. Первыми были определены онкогены вирусов. 1) онкогены вируса саркомы Рауса. Геном этого ретровируса содержит 4 гена, названных gag, pol, env, src. gag-ген кодирует группо-специфичные АГ вируса, pol-ген кодирует обратную транскриптазу,фермент, характерный для ретровирусов. Env-ген кодирует определенные ГП вирусной оболочки, src-ген кодирует фермент тирозин-киназу, которая ответственна за трансформацию. Эта находка имела фундаментальное значение, т.к. показывала специфический биохимический механизм (фосфорилирование ряда белков), который мог объяснить, по меньшей мере частично, как онковирусы вызывают плеотропные эффекты (диверсию) трансформации. Остается выяснить, какие белки подвергаются фосфорилированию с помощью тирозин-киназы и запускают малигнизацию. Винкулин, белок найденный в структурах, вовлеченных в межклеточную адгезию. Фосфорилирование винкулина с помощью тирозин-киназы может объяснить округление форм злокачественных клеток и их уменьшенную адгезию к базальным мембранам и друг к другу при тарнсформации. Определенные гликолитические ферментыявляются белками-мишенями для тирозинкиназы. Это подтверждается тем, что в трансформированных клетках часто повышенный уровень гликолиза. Тирозинкиназа может также фосфорилировать киназы, участвующие в фосфорилировании фосфоинозитола. При этом ФИ превращается в фосфоинозитолмонофосфат и фосфоинозитолдифосфат, что приводит к усилению ФИ-цикла. Когда фосфоинозитол-4,5-дифосфат гидролизуется под действием ФЛС, высвобождаются 2 мессенджера (посредника): инозитолтрифосфат (ИТФ) и ДАГ. ИТФ опосредует высвобождение кальция из внутриклеточных депо (из ЭПР). ДАГ стимулирует активность ПКС, которая фосфорилирует ряд белков, некоторые из которых могут быть компонентами ионных насосов. Предполагается, что мягкое ощелачивание клеток, вызванное активацией натрий-калиевого насоса, может играть роль в стимуляции митоза. Т.о., продукт src-гена (тирозинкиназа) может влиять на большое количество процессов, связанных с фосфорилированием белков и ферментов, стимулируя синтез фосфоинозитидов.

(2) тирозинкиназа в норме и трансформированных клетках:

тирозинкиназная активность характерна не только для трансформированных клеток, но и почти для всех нормальных клеток. Определенные рецепторы (например, для эпидермального фактора роста, инсулина и фактора роста тромбоцитов) найдены как в трансформированных, так и в нормальных клетках. Эти рецепторы  имеют тирозинкиназную активность. Количество фосфотирозина в большинстве нормальных клеток низкое, но обычно повышается в клетках, трансформированных онковирусами, т.к. последние синтезируют собственную тирозинкиназу. Хотя количество фосфотирозина даже в трансформированных клетках относительно малое – 1% от всех фосфоаминокислот (фосфосерин,  фосфотреонин).

Протоонкогены. Спорным вопросом является происхождение вирусных онкогенов. Показано, что ДНК нормальных клеток содержат сходные, если не идентичные онкогенам последовательности. М-РНК и протеины этих нормальных последовательностей могут определяться на различных стадиях жизненного цикла нормальной клетки. Т.о., протоонкогены – это сходные или идентичные онкогенам последовательности в ДНК нормальных клеток и вирусов, ответственных за дифференцировку клеток в норме и другие процессы  и при определенных ситуациях превращаются в онкогены.

Протонкогены превращаются в онкогены посредством различных механизмов.

Существует 5 механизмов превращения протоонкогенов в онкогены.

(1)    Вставка промотора. Определенные ретровирусы бедны онкогенами (например, вирусы птичьей лейкемии), но могут вызывать рак через более длительные периоды (месяцы), чем другие онкогены. ДНК-копия этих вирусов синтезируется при помощи обратной транскриптазы (ревертазы) и эта копия интегрируется в геном хозяина. Интегрированная копия ДНК вируса называется «провирус». Обычно «провирусы» располагаются на концах ДНК хозяина в виде «прыгающих генов». Эти гены могут действовать как промоторы транскрипции. Например, инфицирование цыплят вирусом птичьей лейкемии, копии ДНК этих вирусов располагаются рядом с myc-геном. При этом myc-ген активируется, т.к. вирусная копия ДНК действует в качестве его промотора. Показано, что человеческий C-MYC ген активируется подобным образом и играет роль в развитии колоректального рака у человека.

(2)    Вставка увеличителя. В некоторых случаях провирус, встроенный в ДНК хозяина, ориентируется в обратном направлении, тем не менее myc-ген активируется. Первый (1) и второй (2) механизмы обычно вовлечены в вирусный канцерогенез. Они могут быть классифицированы как примеры вставочного мутагенеза.

(3)    Хромосомная транслокация. Транслокация – это один из типов изменений хромосом в раковых клетках. Суть транслокации заключается в удалении одного из участков хромосомы и затем присоединение этого участка к другой хромосоме. Примером транслокации является Филадельфийская хромосома,включающая изменения между 9 и 22 хромосомами, что наблюдается при хронической миелогенной лейкемии. В 9 хромосоме имеется ген C-ABL, который кодирует тирозинкиназу. При транслокации происходит перемещение гена BCR из хромосомы 22 в 9-ую, что ведет к образованию BCR-ABL комплекса, с которого образуется м-РНК, кодирующая особый белок, повышающий активность тирозинкиназы, что приводит к трансформации нормальных клеток в лейкемические. Лимфома Беркитта – быстро растущий рак человеческих В-лимфоцитов. В данном случае имеет место транслокация 8 и 14 хромосом. Сегмент 8 хромосомы перемещается в 14-ую, в которой находится C-MYC. В результате C-MYC активируется. Продукт C-MYC – ДНК-связывающий белок, являющийся «силой» или «драйвером», превращающей нормальные клетки в злокачественные, т.к. возможно участие этого протеина в регуляции митоза (см. рисунки отдельно).

(4)    Увеличение гена. Это явление обнаружено в большом количестве опухолей. Определенные клеточные онкогены могут увеличиваться и, т.о., активироваться. Показано, что хромосомы с такими генами имеют малые размеры (минихромосомы) с недостатком центромер. Увеличенные гены определяются как гомогенно окрашенные регионы этих хромосом. Увеличенные количества продуктов таких генов (например, c-ras) могут играть роль в прогрессировании опухолевых клеток в более злокачественные.

(5)    Точковые мутации. Вирусный (v-ras) онкоген первоначально был обнаружен в определенных ретровирусах. Его продукт – полипептид с молекулярной массой 21кДа (р21), относится к G-протеинам, которые модулируют активность аденилатциклазы и, т.о., играют ключевую роль в клеточном ответе на многие гормоны и лекарства. Анализ с-ras протоонкогена из нормальных человеческих клеток и с-ras онкогена из раковых клеток человека показал, что они отличаются только по одному основанию, что приводит к замещению аминокислоты в положении 12 у v-ras. Положение мутаций варьирует и поэтому возможны также другие аминокислотные замещения. Эти мутации приводят к снижению ГТФ-азной активности р21, что вызывает хроническую стимуляцию аденилатциклазы. Это может лежать в механизме трансформации нормальных клеток в злокачественные.

Первые 4 механизма включают повышение количества продуктов онкогенов, обусловленную увеличенной транскрипцией, но при этом нет нарушения структуры продукта онкогена. Т.о., увеличение количества продуктов онкогенов может быть достаточным, чтобы подтолкнуть клетку к трансформации в злокачественную. 5-ый механизм – точковые мутации – включает изменение в структуре продуктов онкогенов, но при этом необязательно изменение их количества. Это тоже может быть толчком в трансформации клеток. Активация онкогенов – не единственный путь малигнизации. Часто активация онкогенов сопровождается ингибированием генов-супрессоров опухолей (тумор-супрессоров). Это показано для колоректального и, возможно, для большинства других раковых опухолей. В некоторых случаях активация онкогенов может быть вторичным явлением, связанным скорее с трансформацией, чем вызывающее ее. Эпигенетические изменения также могут быть включены в процесс трансформации клеток, например, химические факторы. Например, активация с-ras онкогена в раковых клетках молочных желез крыс индуцируется нитрозметилмочевиной, под действием которой происходит транзиция (ГàА). Т.о., онкогены могут быть активированы химическим путем.

В геноме обнаружены также гены-супрессоры опухолей, или антионкогены (ген-«охранник» генома – р53 – он репрессирует онкогены и активирует апоптоз;  rb-105 – блокирует транскрипцию). ген RB (ген супрессии ретинобластомы) – в коротком плече 13 хромосомы, ген р53 локализован в коротком плече 17 хромосомы. Продукты этих генов – ядерные фосфопротеиды (рRB и р53). РRB и р53 способны связывать вирусные протеины, блокируя их действие. Уровень р53 увеличивается после воздействия мутагенов, что вызывает остановку клеточного цикла и позволяет произойти необходимой репарации. Р53 имеет 3 эффекта – 1) активатор транскрипции, регулируя работу определенных генов, включенных в клеточный цикл. 2) действует в качестве контроля при повреждении ДНК, останавливая клеточный цикл и давая возможность для репарации ДНК. По этой причине этот ФП называют опекуном генома или полисменом генома. 3) р53 инициирует апоптоз – запрограмированную клеточную смерть. При этом он ускоряет клеточную смерть потенциально опасных клеток – подвергшихся действию канцерогенов и мутагенов. Это еще раз позволяет отнести р53 к опекуну тканей.

В геноме также открыты гены, стабилизирующие ДНК; гены репарации; гены продолжительности жизни.

Апоптоз

Гены, регулирующие продолжительность жизни, регулируют особый процесс –апоптоз. Это процесс запрограмированной клеточной смерти. В большинстве взрослых тканей гомеостаз – это баланс между клеточным ростом и клеточной смертью. Апоптоз – это запрограмированная клеточная смерть, контролируемая специфическими генами. При апоптозе клетки усыхают, их хроматин конденсируется, ДНК  фрагментируются, мембраны образуют вздутия. Ключевым событием апоптоза является активация Са-Mg-эндонуклеазы, которая расщепляет внутринуклеосомальную ДНК. В апоптозе также участвуют каспазы (семейство протеаз). Идентифицировано большое количество генов, вовлеченных в апоптоз. Некоторые из них – онкогены, например, myc (стимулирует апоптоз) и bcl-2 (ингибирует апоптоз). К генам, участвующим в апоптозе относится ген АРТ-1 (FAS), находится в лимфоцитах и кодирует «рецептор смерти». Лигандом для этого рецептора (веществом, связывающимся с рецептором) является TNF – фактор некроза опухоли. Взаимодействие TNF с «рецептором смерти» является пусковым моментом в апоптозе. Сигналами к апоптозу являются мутации, токсины, большие дозы глюкокортикостероидов и др. При этом активируются каспазы и определенные гены (р53, bcl-2, bax). При этом, если в клетке мало АТФ, то развивается некроз (патологическое явление). Если АТФ достаточно или много, то происходит апоптоз. Для развития апоптоза необходимо, чтобы из митохондрий в цитозоль клетки вышли цитохром С, кальций и АТФ. Три этих фактора и каспазы завершают апоптоз. Показано, что в злокачественных клетках отмечается блокирование апоптоза.

Молекулярные болезни и принципы их терапии