Лр №2

	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный аграрный университет»	Методические указания
		С2.Б.11 Ветеринарная микробиология и микология

Кафедра инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы

С2.Б.11 ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам

Направление подготовки

111801 Ветеринария

Профиль подготовки

специализация Ветеринарная фармация

Квалификация выпускника

специалист

Уфа 2013

УДК637.12.04/.07:378.147

ББК 36.95+74.58

А 65

Рекомендовано к изданию методической комиссией факультета биотехнологий и ветеринарной медицины (протокол № 2 от « 04 » сентября 2013 г.)

Составитель: профессор, д-р биол. наук А. В. Андреева

доцент, канд. биол. наук З. З. Ильясова

Рецензент: заведующий кафедрой морфологии,патологии,фармации

и незаразных болезней, д-р ветеринар.наук Гимранов В.В.

Ответственный за выпуск:

зав. кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы, д-р биол. наук, профессор Андреева А.В.

г. Уфа, БГАУ, кафедра инфекционных болезней,

зоогигиены и ветсанэкспертизы

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

Бактериальные краски. Порядок приготовления препаратов.

Простые методы окрашивания.

Цель занятия. Овладеть методикой приготовления мазка-препарата для микроскопии из микробной взвеси. Приготовить, окрасить (фуксином или метиленовой синькой) и зарисовать препараты из микробных культур. Отработать методику простого метода окраски приготовленных препаратов.

Материалы и оборудование. Рабочие растворы красок, спирт ректификат 96%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, спиртовки, спички, кедровое масло, окрашенные препараты стрептококка и диплококка, таблица - морфология микробов.

Приготовление бактерийных препаратов для микроскопирования. Для обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале и изучения их тинкториально-морфологических свойств, необходимо приготовить препараты, окрасить их и изучить под микроскопом.

Препараты для микроскопирования готовят на предметных стеклах. Материалом служат взвеси бактериальных культур, выросших на питательных средах, молоко, гной. Из таких материалов готовят препараты-мазки. Из тканей различных органов – препараты-отпечатки.

Предметные стекла, используемые при этом, должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Стекла хранят в банках с притертыми пробками в смеси из равных частей этилового спирта и эфира или в 96,6% спирте ректификате. Возможно, обезжиривание предметных стекол кусочком мыла.

Нанесение микробной взвеси на стекло производят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Бактериологические петли готовят из платиновых или нихромовых нитей в виде замкнутой петли, диаметром 2-3 мм.

Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов:

• Обезжиривание предметного стекла.

• Приготовление мазка.

• Высушивание препарата.

• Фиксация мазка.

• Окраска мазка.

В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.

Обезжиривание предметного стекла. Стекла, не бывшие в употреблении, сначала моют в воде, затем выдерживают в смеси спирта-эфира, фламбируют над пламенем горелки – это и есть обезжиривание. Новые стекла можно готовить путем кипячения 10 мин. в 1% растворе натрия гидрокарбоната (соды), промывания в дистиллированной воде с добавлением 0,5% соляной кислоты с целью нейтрализации и окончательного споласкивания в дистиллированной воде.

Приготовление мазка. Для приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде, на обезжиренное предметное стекло наносят бактериологической петлей небольшую каплю стерильного физиологического раствора. Затем петлю прокаливают докрасна (стерилизуют фламбированием), внося ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего из пробирки с культурой вынимают пробку захватывая ее мизинцем и ладонью правой руки (рисунок 4).

Пробирку с культурой следует держать левой рукой, пробкой к себе. Вынув пробку, края пробирки обжигают и вносят в нее бактериологическую петлю. Прежде чем захватить небольшое количество культуры, петлю охлаждают, касаясь стенок пробирки. Петлю с культурой осторожно вынимают, еще раз обжигают края пробирки, а культуру вносят в приготовленную ранее каплю физраствора, тщательно размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого овала или круга (1,5-2 см в диаметре). По окончании приготовления мазка петлю вновь прокаливают

Рисунок 4 Схема приготовления препарата-мазка

Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло петлей 1-2 раза наносят исследуемый материал и равномерно распределяют.

Приготовленный препарат высушивают на воздухе, просохший мазок фиксируют.

Пастеровскими пипетками делают мазки из жидкостей и бульонных культур. Пипетка должна быть стерильной. Над пламенем горелки отламывают запаянный конец и набирают материал. После нанесения капли культуры на предметное стекло и ее распределения пипетку отпускают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Мазок высушивают при комнатной температуре.

Фиксация мазка. Фиксацию мазка проводят физическим и химическим способами.

Физический способ фиксации – над пламенем горелки. Для этого предметное стекло с мазком берут большим и указательным пальцами или пинцетом и проводят 3-4 раза над пламенем горелки, каждый раз, прикладывая стекло к коже руки. Ощущение жжения свидетельствует о том, что мазок фиксирован. При этом бактерии погибают, плотно прикрепляясь к стеклу. Этот способ нельзя применять при исследовании клетки.

Химический способ используют для фиксации мазков из крови и мазков-отпечатков, так как при действии высоких температур разрушаются клеточные элементы. Для этого препараты погружают в фиксирующую жидкость: в метиловый спирт - на 5 минут, в этиловый спирт - на 10минут, ацетон - 5 минут, смесь Никифорова (равный объем спирта и эфира) - на 15 минут.

Цель фиксации:

1) Закрепить бактерий на стекле.

2) Умертвить микробные клетки, обезопасив себе работу.

3) Коагулировать белок клетки, после чего она лучше воспринимает краситель.

Окраска мазка. В микробиологической практике для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:

-синие – метиловый синий, водный синий, опаловый синий;

-красные – фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый;

-фиолетовые – метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет;

-зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый;

-желто-коричневые – хризоилин, везувин.

Простой метод окраски - применение раствора одного красителя. Раствором краски покрывают охлажденный фиксированный мазок, выдерживают 2-5 минут, краску сливают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией. Этот способ окраски позволяет обнаружить в материале микроорганизмы и дать некоторые представления об их морфологии.

Задание

1 Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур.

2 Окрасить препараты простым методом (фуксином или метиленовой синькой) и зарисовать.

Вопросы для самоконтроля знаний

1 Красители, применяемые в микробиологии.

2 Способы и цели фиксации.

3 Порядок приготовления препарата для микроскопии и простой метод окраски.

4 Методика приготовления мазка.

5 Способы обработки предметных и покровных стекол.

6 Какие существуют методы фиксации?

Библиографический список

1. Асонов, Н. Р. Микробиология [Текст] : учеб. для студ. Вузов по спец. 310700 «Зоотехния» / Н. Р. Асонов. – 4-е изд., перераб. И доп. – М.: Колос, 2001.

2. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст] : учеб. для студ. вузов по спец. «Ветеринария» / Н. А. Радчук, Г. В. Дунаев, Н. М. Колычев [и др.] ; под ред. Н. А. Радчука. – М. : Агропромиздат, 1991.

3. Кисленко, В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст]: учебник для студ. Вузов, обуч. По спец. 111201 «Ветеринария» / В. Н. Кисленко, Н. М. Колычев. – М. : КолосС, 2006 – 2007.Ч .1Общая микробиология

4. Кисленко, В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст]: учебник для студ. Вузов, обуч. По спец. 111201 «Ветеринария» / В. Н. Кисленко, Н. М. Колычев ; Международная ассоциация «Агрообразование». – М. : КолосС, 2006 – 2007.Ч.3 Частная микробиология

5. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст] : учеб. для студ. вузов по спец. «Ветеринария» / Р.Г.Госманов, Н.М. Колычев, А.А. Барсков. – Омск: Изд-во ОМГАУ, 2008. – 309 с.

6. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст] : учеб. для студ. вузов по спец. «Ветеринария» / В.Н. /В.Н.Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 230 с.

7. Руководство по микробиологии и иммунологии [Текст]: учеб. пособие для студ. Вузов, обучающихся по спец. «Ветеринария», «Ветеринарно-санитарная экспертиза» : допущено МСХ / [Н. М. Колычев и др.] ; под. Общ. Ред. Н. М. Колычева, В. Н. Кисленко. - Новосибирск: Арта, 2010. - 254 с