2.Генетические методы диагностики инфекционных заболеваний (днк-зондирование, пцр). Их принцип, область применения.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ в исследуемом материале обнаруживают нуклеотидные последовательности ДНК возбудителя. К ним относятся метод ДНК-гибридизации и полимеразная цепная реакция.

Метод ДНК- г и б р и д и з а ц и и основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК возбудителя достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для этой второй нити используют ДНК-зонды. Это лабораторно приготовленные фрагменты молекулы ДНК, гомологичные фрагментам ДНК искомого возбудителя. Зонд метят либо радиоактивным изотопом, либо ферментом. В последнем случае для регистрации включения ДНК-зонда в ДНК бактерий, содержащуюся в исследуемом материале, к пробе добавляют субстрат, соответствующий использованному ферменту. Положительная реакция субстрат-фермент проявляется в изменении окраски субстрата и свидетельствует о соответствии ДНК-зонда ДНК возбудителя, находящейся в исследуемом материале.

Чувствительность метода уступает ПЦР (103 микроорганизмов в пробе), что ограничивает его применение как диагностического теста, тем более что аналогичную чувствительность имеют иммунологические методы, выявляющие микробные антигены.

По л и ме р а з н а я ц е п н а я р е а к ц и я (ПЦР) представляет собой метод направленной амплификации (воспроизведения) ДНК, позволяющий найти в исследуемом клиническом материале небольшие участки генетической информации любого организма и многократно размножить их. Для реализации ПЦР создают набор праймеров - фрагментов ДНК, являющихся маркером данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей денатурированную одноцепочечную ДНК, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК.

Образовавшийся двунитевой стартовый участок воспроизводится с помощью фермента Taq-полимеразы, входящей в набор для ПЦР. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации и т. д. Это и есть цепная реакция. В течение нескольких часов происходит 30-40 циклов амплификации. В результате амплификации количество копий специфической нуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в 106-108 раз, что обеспечивает высокую чувствительность метода.

Преимущества молекулярно-генетических методов диагностики состоят в их высокой специфичности и чувствительности. Они позволяют обнаруживать в исследуемом материале единичные клетки возбудителя.

ПЦР имеет три технологические стадии:

❖ выделение и экстракция ДНК (пробоподготовка);

❖ амплификация;

❖ регистрация результатов амплификации.

Вторая стадия ПЦР — циклическая амплификация — протекает поэтапно при определённой температуре реакционной смеси.

Образовавшиеся в каждом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для последующих циклов, при этом число копий ДНК нарастает в геометрической прогрессии (2n, где n — число прошедших циклов амплификации).

Описанные процессы протекают в термоциклере — программируемом термостате, по заданной программе осуществляющем смену температур согласно числу циклов шплификации.

Схема цикла полимеразной цепной реакции:

1 — нативная двухцепочечная ДНК;

2 — денатурация ДНК при температуре 94 °С;

3 — гибридизация (присоединение праймеров при температуре 55⁰ С);

4 — синтез комплементарной цепи ДНК при температуре 72 ⁰С, образование двухцепочечной ДНК.

Визуализацию результатов ПЦР осуществляют электрофоретическим разделением продуктов реакции в агарозном геле или методом гибридизации ампликонов с комплементарным к определяемой последовательности олигонуклеотидным зондом, меченным флюоресцентной, ферментной или другой меткой. Принципиально новое направление развития регистрационных систем — использование оптических биосенсоров, позволяющих определять в ходе гибридизации в реальном режиме времени пикограммовые количества фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на поверхности оптической кюветы.

Достоинства ПЦР:

- высокая чувствительность метода, позволяющая определять 10-1000 клеток впробе;

- высокая специфичность — в исследуемом материале выявляют уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК;

- универсальность процедуры выявления различных возбудителей, что даёт возможность диагностировать несколько возбудителей в одной биопробе;

- высокая скорость анализа — унифицированная обработка биоматериала и детекция продуктов реакции, а также автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 ч;

- возможность проводить количественный анализ и определять число копий специфических последовательностей нуклеотидов в пробе, контролируя таким образом вирусемию или бактериемию (например, вирусную нагрузку при вирусных гепатитах или ВИЧ-инфекции);

- возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. ПЦР можно эффективно использовать для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, её использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Метод ПЦР имеет свои ограничения, в частности, для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенной микрофлорой. Высокая чувствительность ПЦР создаёт опасность получения ложноположительных результатов за счёт минимальных загрязнений ДНК окружающей среды лабораторий, регулярно выполняющих однотипные исследования. Это формирует строгие требования к режиму проведения анализа.