16. Количественное определение содержания гемоглобина крови.

_{Определение содержания гемоглобина в крови цианметгемоглобиновым методом по Драбкину.}

_{Принцип метода. Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием (красная кровяная соль), образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колометрически.}

_{Ход работы. В пробирку (опыт) (осторожно!) отмерить 5 мл. трансформирующего раствора (реактив Драпкина), к нему добавить 0,02 мл крови (разведена в 251 раз). В другую пробирку (стандарт) прилить 5 мл реактива Драпкина и 0,02 мл стандартного раствора. Содержимое обеих пробирок перемешать и в течение 30 минут выдержать при комнатной температуре. Измерить экстинцию опытной и стандартной проб на ФЭКэ при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор).}

_{Расчет содержания гемоглобина произвести по формуле:}

_{Hb(г/л)=Еоп/Ест ×С × К × 0,01, где}

_{Еоп – экстинкция опытной пробы;}

_{Ест – экстинкция стандартного раствора;}

_{С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе (59,75 мг/100мл);}

_{К – коэффициент разведения крови (251);}

_{0,01 – коэффициент пересчета мг/100 мл в г/л.}

_{Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.}

_{У здоровых людей концентрация гемоглобина колеблется в следующих пределах:}

_{- новорожденные – 210 – 225 г/л;}

_{- дети в возрасте 1 месяца – 145 - 165 г/л;}

_{- дети в возрасте 6 месяцев – 115 - 130 г/л;}

_{- дети в возрасте 1 года – 110 - 120 г/л;}

_{- дети в возрасте 14-15 лет – 130 -150г/л;}

_{- взрослые женщины – 120 - 140 г/л, мужчины – 135 - 160г/л.}

_{Клинико-диагностическое значение определения содержания гемоглобина в крови: снижение содержания гемоглобина в крови наблюдается при анемиях различного генеза, при острых и хронических кровотечениях, некоторых инфекционных заболеваниях; повышение – при сгущении крови, при заболеваниях, связанных с увеличением количества эритроцитов (эритремии) и др.}

17. Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека.

_{Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека.}

_{Принцип метода. В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в растворе. Разрушение билирубин-альбуминового комплекса (свободный, или непрямой билирубин) осуществляется кофеиновым реактивом, который одновременно переводит билирубин в растворимое диссоциированное состояние. Интенсивность образующейся окраски измеряется на ФЭКе при зеленом светофильтре (563 нм), а количество билирубина определяется по калибровочному графику.}

_{Ход работы. В 3 пробирки отмерить указанные в таблице реактивы и колориметрировать через 5 - 10 мин. на ФЭКе в кювете 10 мм против контроля при зеленом светофильтре.}

_{По калибровочному графику определить содержание общего и связанного билирубина. Вычитая из уровня общего билирубина количество прямого, рассчитать содержание непрямого (свободного) билирубина. Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.}

Реактивы	Пробирки
	1-я	2-я	3-я
Сыворотка крови	1 мл	1 мл	1 мл
Кофеиновый реактив	3,5 мл	3,5 мл	-
Диазореактив	0,5 мл	-	0,5 мл
Физиологический раствор	-	0,5 мл	3,5 мл
Типы билирубина	общий	контроль	прямой (связанный)

_{Нормальное содержание билирубина в крови – 8,5 – 20,5 мкмоль/л; 75% общего билирубина составляет непрямой (свободный), 25% - прямой (связанный) билирубин.}

_{Клинико-диагностическое значение определения содержания билирубина в сыворотке крови: определение общего билирубина и его фракций используется для диагностики и дифференциальной диагностики желтух различной этиологии – гемолитической (надпеченочной), паренхиматозной (гепатоцеллюлярной, печеночной) и обтурационной (механической, подпеченочной). При гемолитической желтухе гипербилирубинемия развивается в основном за счет непрямого (свободного) билирубина. При паренхиматозной желтухе происходит деструкция гепатоцитов и нарушается экскреция прямого билирубина в желчные ходы, он попадает в кровь. Кроме того из-за функциональной несостоятельности гепатоциты не способны эффективно захватывать из крови непрямой билирубин и конъюгировать его. При паренхиматзной желтухе наблюдается гипербилирубинемия смешанного типа. При обтурационной желтухе нарушается эвакуация желчи в двенадцатиперстную кишку, что приводит к повышению в крови прямого, а в более поздние сроки болезни и непрямого билирубина. 18. Пробы коллоидной устойчивости плазмы крови Вельтмана и тимоловая}

_{Пробы коллоидоустойчивости белков сыворотки крови.}

_{А. Тимоловая проба}

_{Принцип метода. Метод основан на образовании плохо растворимого глобулино-тимололипидного комплекса при взаимодействии сыворотки крови с тимоло-вероналовым буфером.}

_{Ход работы. К 6 мл тимоло-вероналового буфера (рН 7,6) прибавить 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови и через 30 минут отколориметрировать при красном светофильтре в кюветах толщиной 10 мл против тимоло-вероналового буфера. Расчет произвести по калибровочному графику.}

_{В норме интенсивность помутнения колеблется в пределах от 0 до 4 условных единиц.}

_{Б. Проба Вельтмана}

_{Принцип метода. Метод основан на нарушении коллоидоустойчивости белков сыворотки крови в присутствии раствора хлористого кальция при нагревании.}

_{Ход работы. К 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови прилить 4,9 мл воды, перемешать и нагреть над пламенем спиртовки до однократного закипания пробы. Охладить смесь и посмотреть ее содержимое на свет. Если в пробирке нет единичных хлопьев коагулированного белка, добавить еще 0,1 мл 0,5% раствора хлористого кальция и вновь прокипятить. Процедуру повторять до тех пор, пока не выпадут хлопья.}

_{В норме коагуляции наступает при добавлении 0,4 - 0,5 мл раствора хлористого кальция.}

_{Клинико-диагностическое. Осадочные пробы широко распространены в клинической практике. Данная группа проб основана на исследовании изменений коллоидной устойчивости белков сыворотки крови при патологических состояниях, сопровождающихся диспротеинемией (воспалительные заболевания, заболевания печени и почек и др.). Лабильность сывороточных белков, определяемая в первую очередь соотношением крупно- и мелкодисперсных фракций (альбумины/глобулины) и снижением коллоидоустойчивости при действии различных денатурирующих агентов, может быть связана с относительным увеличением глобулинов при уменьшении альбуминов. Большое значение имеет и относительное увеличение γ-глобулинов в глобулиновой фракции.}