8.0Пределснис активности аспартатаминогрансферазы. Колориметрический метод определения активности аспартат- и аланинаминотрансфераз в сыворотке крови.

_{Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики болезней печени. Для острого гепатита характерно раннее повышение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ). При инфаркте миокарда в 95 % случаев в сыворотке крови повышается активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ). В сыворотке крови здоровых людей активность АсАТ колеблется в пределах 0,028-0,139 мкмоль/л×сек, активность АлАТ – 0,028-0,196 мкмоль/л×сек.}

_{Принцип метода. В результате переаминирования при участии АсАТ и АлАТ образуются, соответственно, щавелевоуксусная (ЩУК, оксалоацетат) и пировиноградная (ПВК) кислоты.}

_{СООН СООН СООН СООН}

_{| | | |}

_{СН–NH2 + C=O C=O + СН–NH2}

_{| | ←→ | |}

_{CH2 (CH2)2 АсАТ CH2 (CH2)2}

_{| | | |}

_{COOH COOH COOH COOH}

_{аспартат α-кетоглутарат оксалоацетат глутамат}

_{СООН СООН СООН СООН}

_{| | | |}

_{СН–NH2 + C=O C=O + СН–NH2}

_{| | ←→ | |}

_{CH3 (CH2)2 АлАТ CH3 (CH2)2}

_{| |}

_{COOH COOH}

_{аланин α-кетоглутарат пируват глутамат}

_{Оксалоацетат при декарбоксилировании превращается в пируват. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается и образуется гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.}

_{Техника выполнения работы.}

_{Определение АсАТ.}

_{Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.}

_{Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора, добавляют 0,1 мл сыворотки, помещают в термостат при температуре 37° С на 1 час. Затем добавляют 0,5 мл раствора динитрофенилгидразина и выдерживают при комнатной температуре 20 мин для развития реакции. Затем приливают 5 мл 0,4 н NaOH, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин для развития окраски. Оптическую плотность измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете на 10 мм против контроля.}

_{Контрольная проба. Содержит все ингредиенты опытной пробы за исключением сыворотки крови. Вместо нее берут 0,1 мл дистиллированной воды и инкубируют в тех же условиях, что и опытную.}

_{Определение АлАТ.}

_{Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.}

_{В опытную пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для определения АлАТ, затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и помещают в термостат при температуре 37° С на 30 мин. Дальнейший ход анализа такой же, как при определении АсАТ.}

_{В контрольную пробирку вместо сыворотки крови берут 0,1 мл дистиллированной воды.}

_{Расчет активности ферментов производят по калибровочному графику, отражающему зависимость оптической плотности от содержания ПВК.}