Характеристика стадий пцр

Стадия		Температура, 0С	Экспо-зиция	Описание стадии
Начальная денатурация		90–95	3–10 мин	Большие двухцепочечные молекулы ДНК раскручиваются с образованием одноцепочечных молекул.
25–40 циклов	денатурация	90–95	25с– 1 мин	Небольшие двухцепочечные ампликоны раскручиваются с образованием одноцепочечных молекул.
	отжиг	48–65i	25с– 4 мин	Праймеры прикрепляются к комплементарным фрагментам ДНК-матрицы, образуя дуплексы.
	элонгация	72	25с 4 мин	ДНК полимераза прикрепляется к 3’-концу праймера, соединившегося с ДНК-матрицей, и синтезирует копию, комплементарную ДНК-матрице.
Конечная элонгация		72	510 мин	Образуются дуплексы ДНК.
Хранение		4	-	-

Примечание. температура отжига зависит от нуклеотидного состава праймера и рассчитывается математически.

4

Рис. 34. Источник тока и камера для электрофореза

этап.Визуализация получаемых копий ДНК и регистрация результатов реакции. Образуемый высококонцентрированный раствор ампликонов ДНК прозрачен. Поэтому для выявления ДНК проводят электрофорез в агарозном геле, содержащем флюоресцирующий в УФ-свете ДНК-краситель  бромид этидия. ДНК движется в электрическом поле, взаимодействует с этидием бромидом и при просматривании в трансиллюминаторе (источник УФ света) выглядит в виде светящейся оранжевой полоски. Полученные результаты можно документировать, фотографируя электофореграммы с использованием оранжевого светофильтра.

Рис. 35. Камера для электрофореза с агарозным гелем

Проведение электрофореза (рис. 34, 35). Агарозный гель (0,5–4%) с лунками для образцов опускают в аппарат для проведения электрофореза, так чтобы лунки находились в области катода. В камеру для электрофореза заливают трис-ацетат-ЭДТА буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем составляла 12 мм. Образец смешивают с загрузочным красителем в соотношении 1:6 и вносят 6 – 20 мкл в лунку в геле. Обычно одновременно исследуют много образцов. Загрузочный краситель (зеленый, синий) имеет скорость движения, схожую с ДНК, поэтому по его перемещению судят о местонахождении ДНК в геле. В зависимости от плотности тока время проведения электрофореза составляет от 30 мин до 24 ч. После проведения электрофореза гель вынимают из камеры и переносят на столик трансиллюминатора, где бромистый этидий, связавшийся с ДНК, флюоресцирует в УФ-свете (230 нм), давая оранжевое свечение.

5 этап. Анализ и интерпретация результатов реакции (рис. 36). Для оценки результатов учитывают опытные лунки, а также лунки с положительным и отрицательным контролем (рис. 37, табл. 14).

Рис. 36. Автоматизированная система визуализация гелей –

трансиллюминатор, видеокамера, компьютер