Молекулярно-генетические методы.
Успехи, достигнутые в последние годы в молекулярной биологии, биохимии, медицинской генетике привели к созданию и внедрению в практическую медицину молекулярно-генетических методов. С помощью этих методов исследуется геном человека и осуществляется диагностика целого ряда наследственных и широко распространенных заболеваний. Методы ДНК-диагностики позволяют осуществлять точную и, что очень важно, доклиническую (до развития симптомов заболевания) диагностику многих заболеваний, проводить пренатальную (дородовую) диагностику наследственных болезней. Молекулярно-генетическая диагностика может быть проведена на самых ранних этапах развития эмбриона и плода независимо от биохимических или клинических проявлений болезни. Это подчас является решающим для решения вопроса о судьбе конкретной беременности.
Молекулярно-генетические методы предназначены для выявления особенностей в структуре ДНК.
У каждого человека во всех соматических клетках структура ДНК совершенно одинакова.
ДНК может быть выделена из любого типа тканей или клеток организма, содержащей ядра. Чаще всего для получения образцов ДНК используют лейкоциты периферической крови и клетки ворсин хориона.
В 70-е годы 20 века вследствие интенсивного развития молекулярной биологии и создании совершенной методической базы генетических исследований возникло направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК – генное зондирование (гибридизационный анализ). Регистрация последовательностей небольшой длины до 30 пар нуклеотидов осуществляется с помощью синтезированных с радиоактивным мечением участков ДНК, названных зондами. Такие зонды гибридизировались с изучаемыми образцами ДНК. В этом подходе использовались универсальные свойства нуклеиновых кислот образовывать двойные нити, соединяясь между собой за счет комплиментарных нуклеотидов и образуя классические пары: аденин-тимин (АТ) и гуанин-цитозин (ГЦ). Если известна первичная структура нормального и мутантного аллелей искомого гена, то для обнаружения повреждения вводят зонд, который специфически соединяется либо с нормальным, либо с мутантным геном. Патология выявляется путем обнаружения радиоактивных импульсов на рентгеновской пленке. Этот метод широко применяется в практике диагностики наследственных болезней. В настоящее время с его помощью проводится диагностика талассемий, фенилкетонурии, недостаточности альфа-антитрипсина.
Полимеразная цепная реакция.
Полимеразная цепная реакция – это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и копировать с помощью термостабильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК. В основе метода лежит многоцикловый процесс, напоминающий естественную репликацию ДНК, при чем каждый цикл состоит из 3-х этапов.
На первом этапе при высокой температуре 70-800 С ДНК денатурируется на две отдельные цепи.
На втором этапе к определенному участку каждой цепи ДНК присоединяются праймеры. Праймеры – это последовательности нуклеотидов, специфичные для каждого гена. Они комплементарны известным нуклеотидам. Этот этап протекает при t 370 С.
На третьем этапе происходит синтез новых цепей ДНК при участии фермента ДНК-полимеразы, опять при высокой t. Эти этапы повторяются до получения стабильного продукта ПЦР.
Дальнейший продукт ПЦР подвергается электрофорезу и анализу.
ПЦР эффективно используют в дородовой диагностике. Достаточно небольшого количества клеток ворсин хориона или других клеток плода, чтобы исследовать их и дать через два дня заключение о наличии или отсутствии у будущего ребенка мутантного аллеля.
Сегодня молекулярно-генетические методы используются для диагностики более 300 наследственных болезней: гемофилии, гемоглобинопатий, митохондриальных болезней, муковисцедозе и т.д.
Кроме того ДНК-технологии находят свое применение для расшифровки генома человека, в судебной медицине, для определения отцовства и степени родства, для анализа клеток красного мозга донора и реципиента при трансплантации органов.