Современная_генетическая_диагностика

Анализ конформационого полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP)

SSCP - single strand conformation polymorphism

Феномен:

Разная подвижность одноцепочечных молекул ДНК одной длины за счет различий в конформации, определяемых нуклеотидным составом цепочки

Стадии:

1.Амплификация в ПЦР с меткой

2.Денатурация ДНК (t)

3.Гель-электрофорез

4.Детекция метки

Преимущества ПЦР в реальном времени

1.Существенное повышение специфичности метода за счет наличия внутреннего зонда;

2. Возможность количественного определения;

3. Надежность из-за снижения риска контаминации (за счет проведения всех стадий ПЦР в одной пробирке и отсутствия стадии электрофореза);

4. Возможность создания мультиплексных систем,

позволяющих детектировать несколько возбудителей в одном образце;

5. Снижение времени проведения реакции.

ПЦР в реальном времени

В состав ДНК-зонда входит флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. В ходе ПЦР происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению свечения

Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность детектировать флуоресценцию

ДНК-чипы

– новые ДНК-технологии, позволяющие проводить одновременное определение от нескольких десятков до нескольких тысяч известных точечных мутаций или полиморфизма в известных участках генома. По своей сути, предложенная в 1975 году Эд Саузерн методика блот-гибридизации – использование иммобилизованной на твердой подложке меченой нуклеиновой кислоты для детекции специфической последовательности среди ДНК – была прообразом современных ДНК-чипов.

Метод ДНК-чип диагностики основан на гибридизации неизвестной нуклеотидной последовательности на известных последовательностях олигонуклеотидов, иммобилизированных на твердой поверхности. Результат гибридизации, которая происходит в случае идентичности неизвестной нуклеотидной с известной иммобилизированной последовательностью олигонуклеотидов, детектируется по флуоресценции зонда, предварительно меченного флуорофором и гибридизованного с одной из иммобилизованных проб.

(Рис. с сайта http://lytech.ru/Basic/navigator.htm "Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе» МОМЫНАЛИЕВ К.Т., ГОВОРУН В.М. "Клиническая лабораторная диагностика" No 5, 2000).

Прямое секвенирование

Реакция идет аналогично ПЦР но в реакционную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеоида обладающих способностью тормозить продолжение синтеза новой копии ДНК - ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP.

Тем самым, в растворе оказываются синтезированные фрагменты ДНК разной длины, размер которых определяется различными способами и на основе числовых способов обсчета выстраивается нуклиотидная последовательность изучаемого фрагмента

(слайд из книги «Генетика», под ред.В.И.Иванова, М, 2006)

Биохимические методы диагностики наследственных болезней обмена веществ (НБО)

К наследственным болезням обмена веществ (НБО) относится обширная группа моногенно наследующихся заболеваний (более 700 нозологических единиц), обусловленных мутациями генов, под контролем которых осуществляется синтез белков, которые выполняют различные функции в организме – ферментного катализа, структурные, транспортные. При невысокой частоте отдельных нозологических форм НБО, их суммарная частота довольно высока и составляет примерно 1:3000. Маркерами НБО являются биохимические признаки, поэтому биохимические методы, включающие энзимодиагностику и количественное определение метаболитов, играют важнейшую роль в диагностике этих заболеваний.

Диагностика НБО включает несколько этапов:

1.Выявление дефектного звена метаболического пути посредством анализа (количественного, полуколичественного или качественного) соответствующих метаболитов

2.Выявление дисфункции белка посредством оценки его количества и/или активности

3.Выяснение природы мутаций, т. е. характеристика мутантного аллеля на уровне гена

Такая программа используется не только для решения научных проблем, касающихся изучения молекулярных механизмов патогенеза НБО и выявления гено-фенотипических корреляций. Она необходима прежде всего для практической диагностики НБО.

Верифицировать диагноз на уровне белка и/или мутантного гена необходимо как для проведения пренатальной диагностики, медико-генетического консультирования, так и в ряде случаев для назначения адекватной терапии.

Генетическая диагностика

•Моногенные наследственные заболевания

•Мультифаткорные заболевания

•Фармакогенетика

•Онкогенетика

Муковисцидоз (кистозный фиброз / CF)

Аутосомно-рецессивное наследственное заболевание с распространенным поражением эндокринных желез, характеризующаяся кистозным перерождением поджелудочной железы, желѐз кишечника и дыхательных путей из-за закупорки их выводных протоков вязки секретом.

Изменения белка (трансмембранного регулятора, CFTR), обеспечивающего функцию хлоридного канала приводит к нарушению транспорта хлоридов и воды в эпителиальных клетках. Избыточное выделение хлоридов. Дегидратация секрета. Закупорка вязким секретом выводных протоков желѐз. Развитие воспалительного процесса с присоединением вторичной инфекции.

Задержка умственного и физического развития. Средняя продолжительность жизни – 30 лет. Лечение - антибиотикотерапия, лаваж бронхолегочной системы, систематическое применение пищеварительных ферментов.

Частота. МД ~ 1:2000 – 1:4000 новорожденных

Молекулярная генетика. Ген трансмембранного регулятора хлоридного канала (CFTR) на хр. 7 q31q32. 250 000 п.н. 27 экзонов 1480 ак. Известно более 300 мутаций, из них более 200 с патологическим эффектом (миссенс, делеции, нонсенс, сдвиг рамки, нарушения сплайсинга). До 70% всех случаев –

делеция 3 п.н. в кодоне 508 - F-508, приводящая к делеции фенилаланина в белке.