03_Растения_как_источник_БАВ

Для обеспечения роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма необходим подбор ингредиентов среды культивирования, которые проводят по двум направлениям и оценивают:

- влияние среды на формирование биомассы;

- влияние состава среды на синтез вторичных продуктов.

Компоненты среды для выращивания культур клеток растений должны включать: основные неорганические питательные вещества, источники железа, органические добавки (витамины, регуляторы роста), источники углерода, о чем говорилось выше.

Существует несколько стандартных питательных сред, широко используемых при культивировании, но количество регуляторов роста в них варьирует в зависимости от вида растений. на выход продукта может влиять концентрация источника углерода и других компонентов среды. Так в культуре клеток Барвинка розового увеличение выхода алкалоидов было связано с увеличением в среде концентрации сахарозы, а в культуре клеток моркови накопление антоциана стабилизировалось, когда в качестве лимитирующего фактора использовали фосфаты.

В качестве регуляторов роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма используют ауксины, среди которых индолил-3-уксусная кислота, нафтилуксусная кислота, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, а также цитохинины. На синтез вторичных метаболитов влияют внесенные в питательную среду извесные предшественники, которые могут стимулировать определенные ферментативные пути метаболизма. Так внесение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивало выход диосгенина примерно на 100%. На степень накопления вторичных метаболитов влияют также свет, температура, pH, а при суспензионном суспензировании культивировании – аэрация и перемешивание, скорость вращения сосудов, газовый состав и т.д.

Таким образом, создавая для каждой культуры клеток растений благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов, можно гарантировать получение любого продукта с метаболической активностью.

Для накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений используют каллусные и суспензионные культуры, последние получают из каллусных.

Технология получения растительного сырья на основе каллусных культур имеет ряд преимуществ – это надежность и стабильность выхода биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а также возможность использования каллусной системы для иммобилизации и последующей биотрансформации, но обладает существенным недостатком – необходимостью применения ручного труда.

В России разработана технология получения субстанций женьшеня, родиолы розовой, унгерии на основе каллусных культур. Данные препараты нашли применение в медицине, косметике и пищевой промышленности. при внедрении технологии суспензионного культивирования необходимо учитывать основные свойства растительных клеток: клетки растений в 50-100 раз больше, чем клетки грибов; в результате роста клетки увеличиваются в размерах, в них появляется большая вакуоль; суспензионные культуры состоят из клеточных агрегатов; наличие целлюлозной клеточной оболочки; интенсивность дыхания.

Выращивание растительных клеток осуществляется в сосудах различного объема (до 200 литров) с системами перемешивания (турбинное, восходящими потоками воздуха, встряхивания).

В настоящее время применяют многостадийные способы получения биомассы и продуктов вторичного метаболизма:

- выращивание в аэрируемом реаторе;

- перенос клеток из одной среды в другую, более богатую микро- и макроэлементами, питательными веществами, но лишенную органических добавок;

-последующее добавление в конце цикла органики.

В основном клетки выращивают в периодическом реакторе. Для повышения выхода продуктов вторичного метаболизма разрабатываются применительно к растительным клеткам методы иммобилизации, биотрансформации. На моделях ряда клеточных культур, например, кукурузы было показано, что синтез и накопление вторичных метаболитов связаны с агрегатным состоянием, отмечается, что чем ближе клетки и группы клеток к целому растению, тем выше у них метаболический потенциал. Имеется, однако, много данных об обратной зависимости между агрегатным состоянием и накоплением вторичных метаболитов. Это связано с двумя типами механизмов. Первый основан на том, что определяет уровень агрегации клеток, а достаточная ее степень может быть достигнута в медленно растущих культурах. Второй механизм связан с кинетикой скорости роста и предполагает, что первичные и вторичные пути метаболизма по-разному конкурируют за предшественники в быстро и медленно растущих клетках.

Исходя из выше сказанного, очевидно, что иммобилизированные клетки, обладающие низкой скоростью роста, способны к интенсивной выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток – выделение метаболита в питательную среду, из которой он может быть легко извлечен. К таким культурам относятся клетки, продуцирующие алкалоиды. Преимущества иммобилизированных клеток по сравнению с суспензионными культурами следующие:

- многократное использование биомассы;

- четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма;

- увеличение продолжительности культивирования на стадии продуцирования;

- получение большого количества вторичных метаболитов.

Другим перспективным вариантом использования культур клеток растений в фармацевтической промышленности следует считать их применение для биотрансформации.

Биотрансформация – метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения, которые способны менять функциональные группы добавленных извне химических соединений. Этот метод пригоден для повышения биологической активности данной конкретной химической структуры и осуществления серии специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов.

Возможность применения биотрансформации при синтезе некоторых соединений была показана на примере превращения дигитоксина в дигоксин клетками Digitalis lanata (наперстянки шерстистой). После 10-дневной инкубации клеток D.lanata в «ростовой» питательной среде (Мурасигё и Скуга) культуру клеток переносили в «продукционную» среду (8% раствор глюкозы) с субстратом для биотрансформации – дигитоксином. В этих условиях весь дигитоксин в течение 2 дней трансформировался в деацетиллантозид С (дигоксин) и пурпургликозид А 88% и 12% соответственно.

Дигитоксин и дигоксин принадлежат к группе "карденолидов", применяемых для лечения хронической болезни сердца.

В настоящее время названные соединения стоят на шестом и восьмом месте в списке наиболее распространенных препаратов США, но использование дигоксина предпочтительнее из-за его меньшей токсичности, по сравнению с таковой у дигитоксина. Оба соединения в США получают путем экстрагирования плантационно выращиваемых растений, но при этом выделяется в основном дигитоксин.

Недифференцированные культуры Digitalis не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять определенные реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду. Биотрансформация дигитоксина в дигоксин происходит за счет реакции 12-гидроксилирования, катализируемой ферментом, содержащимся в клетках Digitalis lanata. Работа была проведена с использованием свободных недифференцированных суспензионных культур в Германии в 1977 г, а к настоящему времени внедрена в производство; достигнут выход дигоксина в пределах 700 г/л в 20-ти литровом реакторе за 17 суток культивирования. Таким образом, основные проблемы, связанные с биотрансформацией сердечных гликозидов клетками Digitalis lanata в настоящее время разрешены. Однако для дальнейшего развития этого направления необходима дальнейшая селекция специализированных линий клеток и оптимизация условий их культивирования, сокращение времени ферментации и увеличение срока работы клеток. Основные условия для перевода лабораторных методов культивирования клеток растений в промышленное производство – это экономически оправданные и относительно простые технологии культивирования клеток и выделения конечных продуктов.

Например, производство аймалина на основе меристемных культур Раувольфии стало реальным, когда в ходе селекционной работы и отбора были получены субклоны клеток, которые синтезируют этот алкалоид на порядок выше, чем исходные материнские штаммы.

Производство серпентина на основе суспензионных культур частично дифференцированных клеток меристемы Catharatus roseus оказалось эффективным и экономически оправданным лишь после того, как были получены субклоны, способные накапливать за 10-ти суточный цикл выращивания до25 г сухого вещества на 1 литр суспензионной культуры.

Аналогичная ситуация имела место и при организации биотехнологического производства настойки женьшеня. Количественный выход биологической субстанции в пересчете на сухое вещество каллуса женьшеня было ниже, чем из женьшеня, полученного при плантационном выращивании, примерно в 3-4 раза.

Производство био-женьшеня стало экономически оправданным лишь после того, как удалось повысить продуктивность его каллусных культур, сохранив без изменений реактогенные свойства экстрагируемых лекарственных настоек. Оказалось, что чем более дифференцированы клетки меристемы в культуре, тем выше их продуктивность. Разработана технология получения в культуре так называемых «бородатых» корней, где по условиям роста в скоплении клеток возникают субпопуляции с повышенной дифференцировкой. Эти популяции являются самыми продуктивными по биологически активным веществам.

Вопросы для самоконтроля:

1. К какому типу метаболитов растений относятся алкалоиды?

2. Какие химические структуры наиболее технологично получать с помощью растительных продуцентов?

3. назовите основные биотехнологические формы растительных продуцентов;

4. назовите основные причины необходимости разработки биотехнологических растительных продуцентов.

17