Министерство образования Российской Федерации

НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Методические указания

к выполнению лабораторных работ

по дисциплине «Биохимия»

для студентов 2-го курса специальности:

271200 «Технология продуктов общественного питания».

271203 «Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий»

НОВОСИБИРСК

2001

Составитель Т.В.Дерюшева, канд. техн. наук, доц.

Рецензент: И.В.Мацейчик, канд. техн. наук, доц.

Работа подготовлена на кафедре ТПП

Пояснительная записка

Методические указания для лабораторных работ по дисциплине «Биохимия» составлены в соответствии с программой курса для специальности 271200 «Технология продуктов общественного питания» и 271203 «Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий».

Занятия придерживаются определенной структуры, включающей цель занятия, материальное обеспечение, методические указания, ход выполнения опытов, задания, контрольные вопросы, оказывающие помощь студентам к теоретической подготовке по темам.

При выполнении лабораторных работ особое внимание уделяется основным веществам в жизнедеятельности организма: белкам, ферментам, углеводам и липидам.

Целью лабораторных работ является закрепление теоретического материала по дисциплине, а также опытного подтверждения некоторых биохимических свойств веществ, участвующих в обменных процессах организма.

В плане лабораторных работ предусмотрены коллоквиумы, контрольные работы и тестирование студентов, позволяющие контролировать и закреплять теоретические знания и практические навыки.

Занятие 1 Тема: Белки. Цветные реакции на аминокислоты.

Цель: Получить представление о возможности распознавания белковой природы веществ и аминокислот, входящих в их состав; получить опыт в качественном определении некоторых аминокислот в продуктах питания с помощью «цветных реакций».

Материальное обеспечение:

Продукты: яичный белок, 1%-ный раствор; желатин, 1%-ный раствор.

Реактивы: гидроксид натрия, 10%-ный раствор; медь сернокислая, 1%-ный раствор; нингидрин, 0,5%-ный раствор; азотная кислота, конц.; серная кислота конц.; уксуснокислый свинец - 0,5%-ный раствор; сахароза - 10%-ный раствор; гидроксид аммония конц.

Посуда и оборудование: штатив с пробирками; набор пипеток глазных; водяная баня; электроплитка; спиртовка; восковой карандаш; спички; держатель для пробирок.

Методические указания

При гидролизе белка образуются различные аминокислоты.

«Цветные реакции» характерны для определенных группировок или для боковых радикалов тех или иных аминокислот. «Цветные реакции» лежат в основе многих методов количественного колориметрического определения аминокислот в белках и полипептидах. «Цветные реакции» можно проводить с раствором яичного белка, желатина, а также с растворами белков продуктов растительного и животного происхождения.

Опыт 1. Биуретовая реакция (реакция Пиотровского)

Биуретовая реакция обусловлена наличием в соединениях пептидной группировки (-СО-NH-). Белки, пептоны, пептиды, амиды и имиды кислот дают с солями меди в щелочной среде окрашенный биуретовый комплекс. Схематично реакцию можно представить следующим образом:

NaOH

...- NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-...

R₁ R₂ R₃ R₄

Полипептид (кетоформа)

OH OH OH OH

Cu(OH)₂

...=N-CH-C=NH-CH-C=NH-CH-C=NH-CH-C=...

R₁ R₂ R₃ R₄

Полипептид (енольная форма)

R₂

N CH C = N

C O CH - R₃

R₁ - CH O Cu C

N N OH

_{... ...}

Окрашенный биуретовый комплекс

Для медных биуретовых комплексов различных соединений характерна окраска от красной через фиолетовую до синей с максимумом поглощения в интервале от 440 до 640 нм, что используется при количественном определении общего белка в исследуемом продукте.

Окраска биуретового комплекса зависит от качества медной соли в растворе и от структуры вещества, с которым координирован ион меди. Продукты распада белка - пептоны и полипептиды дают биуретовую реакцию с красным оттенком. Присутствие в исследуемом растворе белка аммонийных солей, например, сернокислого аммония, препятствует образованию окрашенного продукта. В этом случае для успешного проведения реакции требуется брать большой избыток щелочи. Избыток медного купороса маскирует образование окраски.

Ход работы:

В пробирку наливают 5 капель 1%-ного раствора яичного белка. Затем приливают 5 капель 10%-ного едкого натра и 1 каплю 1%-ного раствора сернокислой меди. Отмечают окраску. Результаты работы записывают в табл.1.

Опыт 2. Нингидриновая реакция.

Реакция основана на взаимодействии аминокислот и аминов с нингидрином. Большинство аминокислот дает красно-фиолетовое окрашивание, аспарагин - оранжево-коричневое, пролин и оксипролин -желтое.

Нингидрин (трикетогидринденгидрат) вызывает окислительное дезаминирование аминокислот с образованием конденсированного соединения розовато-фиолетового цвета («пурпура Руэманна»):

Нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их количества в биологических объектах.

Ход работы:

В одну пробирку вносят 5 капель 1%-ного раствора яичного белка, в другую - 5 капель 1%-ного раствора желатина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли 0,5%-ного раствора нингидрина, закрывают пробирки плотно пробками и нагревают на кипящей водяной бане 18 минут. Через 2-3 минуты в обеих пробирках появляется окраска. Результаты работы записывают в табл. 1.

Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция.

Эта реакция на белки с образованием нитропроизводных ароматических и некоторых гетероциклических радикалов. При взаимодействии белка с азотной кислотой происходит нитрование ядра ароматических аминокислот, содержащихся в белке, с образованием окрашенных соединений. С помощью ксантопротеиновой реакции в составе белка можно обнаружить такие циклические аминокислоты, как фенилаланин, тирозин, триптофан и др.

Реакция протекает по следующей схеме:

Ход работы:

В одну пробирку наливают 5 капель 1%-ного раствора яичного белка, в другую - 5 капель 1%-ного раствора желатина. В обе пробирки добавляют по 2-3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно нагревают на спиртовке до кипения, все время перемешивая. При нагревании раствор и осадок окрашивается в желтый цвет, если белок содержит ароматические аминокислоты. Охладив смесь, осторожно, по каплям добавляют избыток гидроксида аммония. При этом желтая окраска раствора переходит в оранжевую. Результаты работы записывают в табл.1.

Опыт 4. Реакция Фоля.

Белок, содержащий в своем составе серу, при нагревании с раствором щелочи гидролизуется, сера отщепляется в виде сероводорода, который тут же превращается в сульфид натрия. Таким образом, для обнаружения серы в белках требуется разрушение белковой молекулы. Отщепляющуюся серу можно определить, например, с помощью уксуснокислого свинца, который реагирует с сульфидом, образуя черный осадок сернистого свинца:

(CH₃COO)₂Pb + Na₂S 2CH₃COONa +PbS

Если количество серы в белке незначительно, вместо осадка образуется коричневый раствор.

Реакция обусловлена присутствием в белке серусодержащих аминокислот: цистеина, цистина и метионина.

Ход работы:

В две пробирки наливают по 5 капель яичного и желатинового растворов. В каждую пробирку добавляют двойной объем 10%-ного гидроксида натрия. Содержимое пробирок перемешивают и осторожно кипятят в течение 1-2 мин. Затем в каждую пробирку приливают по 5 капель уксуснокислого свинца и вновь нагревают. Наблюдают за изменением окраски в пробирках. Результаты работы записывают в табл.1.

Опыт 5. Реакция на триптофан

При последовательном добавлении к белку раствора сахарозы и концентрированной серной кислоты на границе двух жидкостей образуется красно-фиолетовое кольцо.

Реакция обусловлена наличием в белке триптофана, который реагирует с оксиметилфурфуролом, образующимся из фруктозы и дает окрашенные продукты конденсации. Концентрированная серная кислота участвует в реакции как водоотнимающее вещество.

Ход работы:

В одну пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, в другую - 5 капель раствора желатина. В каждую пробирку добавляют по одной капле 10%-ного раствора сахарозы, перемешивают, отмечают объем полученных растворов. Затем в первую и вторую пробирки добавляют такой же объем концентрированной серной кислоты. Пробирки ставят не менее, чем на 2-3 минуты на кипящую водяную баню. Наблюдают появление красно-фиолетового окрашивания в растворе, где присутствует в белке триптофан. Наблюдают за изменением окраски в пробирках. Результаты работы записывают в табл.1.

Таблица 1

Цветные реакции на белки и аминокислоты

Название реакции	Употребляемые реактивы	Сущность реакции	Исследуемый материал	Наблюдаемая окраска
1. 2. 3. 4. 5.

Задание:

1. Изучить методические указания и ход предлагаемых работ.

2. Провести выше описанные опыты.

3. Письменно подготовить отчет по занятию: записать цель, название опытов, ход их проведения, химические реакции, результаты опытов и выводы.

4. Сделать общий вывод об аминокислотном составе и полноценности яичного белка и желатина.

5. Защитить работу и сдать теоретический материал по контрольным вопросам темы: «Аминокислоты».

Задание для СРС: подготовить теоретический материал по теме: «Химия белков»

Контрольные вопросы:

1. Основные признаки живой материи

2. Структурная организация клетки

3. Что называется аминокислотами?

4. Какие классификации аминокислот известны?

5. Назовите представителей нециклических аминокислот из группы:

- моноаминомонокарбоновых кислот;

- гидроксиаминомонокарбоновые ;

- серусодержащие;

- моноаминодикарбоновые;

- диаминомонокарбоновые;

6. Перечислите основные циклические аминокислоты.

7. Какие из перечисленных аминокислот обладают:

- кислотными свойствами?

- основными?

- амфотерными?

8. Назовите незаменимые, полузаменимые и заменимые аминокислоты.

9. Дайте характеристику отдельных аминокислот.

10. Какие из них входят в знаменитую триаду по физиологической важности?

11. Назовите известные вам «цветные реакции», свойственные соответствующим аминокислотам.