11)Механизм мутаций: делеция, транслокация, инверсия.

Хромосомные мутации носят характер крупных перестроек в отдельных фрагментах ДНК. Они возникают в результате выпадения меньшего или большего числа нуклеотидов (делеция), либо поворота участка ДНК на 180° ( и н в е р с и я ) , либо повторения какого-либо фрагмента ДНК ( д у п л и к а ц и я ), либо межхромосомной перестройки, при которой происходит перенос участка одной хромосомы на другую (транслокация). Один из механизмов образования хромосомных мутаций связан с перемещением Is-последовательностей и транспозонов из одного участка ДНК в другой или из репликона в репликон (из хромосомы в плазмиду и наоборот). В результате возникает мутация, так как функция гена при включении транспозируемого элемента нарушается. При перемещении они могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК — дупликации в 6-9 пар нуклеотидов.

12)Методы изучения антибиотикочувствительности бактерий r – пл./ метод серийных разведений, диффузия в агар/ и гнотобиология/ на модели безмикробных животных.

Основными методами определения антибиотикочувствительности бактерий in vitro является метод серийных разведений, диффузии в агар (бумажных дисков), определение способности к продукции бета- лактамазы, in vivo- на модели безмикробных животных, определение концентрации антибиотиков в крови и моче.

Метод серийных  разведений Методом  серийных  разведений  МИК  определяют  по  минимальной  концентрации  антибиотика, задерживающей видимый рост микроорганизма в пробирках (макрометод), лунках планшета (микрометод) или на чашках с питательной средой, содержащих убывающие концентрации антибиотика.  Например,  для  определения  МИК  тетрациклина  в  отношении  культуры Staphylococcus aureus , выделенной от больного,  готовят двукратно убывающие концентрации этого антибиотика в стандартном питательном  бульоне (Бульон  Мюллера-Хинтона).  Контролями  культуры  и  антибиотика  являются, соответственно, бульон без антибиотика и бульон с первым разведением антибиотика. В опытные и контрольные пробирки вносят стандартизованную суспензию молодой агаровой культуры  S. aureus и после суточной инкубации учитывают результат. Учетным признаком является наличие или отсутствие мутности бульона (роста культуры) в пробирках. В  контроле культуры должна быть мутность, в контроле антибиотика - нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации тетрациклина, при которой отсутствует мутность (бульон в пробирке прозрачен). Допустим, бульон будет мутным в опытных пробирках с концентрациями 1, 2, 4 и 8 мкг/мл, а в пробирках с концентрациями 16, 32 и 64 мкг/мл прозрачным. В этом случае МИК тетрациклина = 16 мкг/мл. Известно,  что  величина  К  тетрациклина  при  введении  среднетерапевтических  доз - 4  мкг/мл (при использовании максимальных доз - 10 мкг/мл). Следовательно, в данном случае терапевтический индекс будет равен Т = 16:4 = 4 (> 0,3), т.е. возбудитель устойчив к антибиотику и лечение тетрациклином не даст антимикробного эффекта в отношении S. aureus  у данного больного, даже при введении максимальных доз (Т = 16:10 = 1,6).  Серийные  разведения  в  плотных  средах (Агар  Мюллера-Хинтона,  М173)  чаще  используют  для одновременного тестирования большого количества микробных штаммов (для посева можно использовать специальный штамп-репликатор). Учетным признаком в этом случае является наличие или отсутствие роста на поверхности агара. Метод серийных разведений нередко считают наиболее точным, хотя и относительно трудоемким,  дорогим. В действительности, при правильной постановке и соответствующих контролях диффузионные методы в ряде случаев не уступают ему по точности. Вместе с тем методом серийных разведений можно тестировать чувствительность более широкого круга микроорганизмов (включая анаэробные, медленно-растущие и прихотливые).

Диско-диффузионный метод При определении чувствительности методом диффузии в агар чистую культуру возбудителя засевают «газоном» на питательный агар в чашке, например, тампоном, смоченном в стандартизованной (108 КОЕ/мл) суспензии  микроорганизма.  Затем  на  поверхность  агара  укладывают  стандартные  бумажные  диски, пропитанные антибиотиками, которые диффундируют в агар, создавая градиент концентрации. На чашку диаметром 90 мм равномерно укладывают 6-7 дисков. После инкубирования в термостате измеряют диаметры  зон  задержки  роста  вокруг  дисков  и  по  специальным  таблицам  определяют  степень чувствительности ктому или иному антибиотику.Существует линейная связь между логарифмом МИК, измеренной при использовании метода серийных разведений, и диаметром зоны задержки роста при использовании диско-диффузионного метода.Поскольку для получения результатов методом диффузии в агаре используют стандартизованные условия (состав и количество среды, количество засеваемых микробов, температура и сроки инкубирования, стандартные диски и др.), каждому значению диаметра зоны вокруг диска с антибиотиком соответствует определенное значение МИК. Исходя из значения МИК, можно определить терапевтический индекс: Т=МИК/К (см. выше).  Следовательно, по диаметру зоны можно определить степень чувствительности к тому или иному антибиотику: чувствительные (S), умеренно-устойчивые (I) и устойчивые (R). К  категории S (от англ. sensitive, чувствительный) относят те, для которых использование средних терапевтических доз будет достаточным для трехкратного превышения МИК.  В  категорию I (от англ. intermediate, промежуточный) относят те микробы, для подавления которых потребуются максимальные терапевтические дозы. Категорию R (от англ.  resistant, устойчивый) составляют те микроорганизмы, в отношении которых данный антибиотик будет неэффективным in vivo.

Существует ряд причин, обусловливающих различную чувствительность микроорганизмов к антибиотикам in vitro и  in vivo.На антимикробную активность in vitro влияют многие факторы, в том числе :

- рН среды;

- компоненты среды;

- концентрация микроорганизмов;

- условия и время культивирования.

На антимикробную активность препаратов in vivo также влияют различные факторы, из которых необходимо отметить:

- фармакодинамику препарата в организме (скорость всасывания, выведения, расщепления и т.д.);

- локализацию микробов в организме (особенно внутриклеточную локализацию).