eur-eq6411-9601_25-OH-vitamin-D

_____________________________________________________________________________________________________

Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2012/12311 от 07.06.2012

25-OH Витамин D ИФА

(25-OH Vitamin D ELISA)

Иммуноферментный тест для количественного определения 25-OH витамина D в сыворотке и плазме крови человека

НАЗНАЧЕНИЕ

Набор предназначен для диагностики дефицита или передозировки витамина D, при снижении всасываемости витамина D в кишечнике, гипокальцемии, гипофосафатемии, гипокальцеурии, при повышенном уровне щелочной фосфатазы, при деминерализации костной ткани.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Набор для иммуноферментного анализа 25-ОН витамин D ИФА (25-OH Vitamin D ELISA) предназначен для количественного in vitro определения 25-ОН витамина D в сыворотке и плазме крови. В набор включены 8- луночные стрипы, разделяемые на отдельные лунки, с иммобилизованными моноклональными антителами к 25-ОН витамину D. На первой реакционной стадии в лунках инкубируют калибраторы и исследуемые образцы, разведенные с 25-ОН витамином D, меченным биотином. В течение инкубации неизвестное количество витамина D в образце пациента и известное количество меченного биотином витамина конкурируют за сайты связывания с иммобилизованными антителами. Несвязавшийся 25-ОН витамин D удаляется промывкой. Для выявления связавшегося меченного биотином 25-ОН витамина D проводят вторую инкубацию, используя стрептавидин, меченный пероксидазой. Связавшаяся пероксидаза вызывается цветное окрашивание во время третьей реакции с субстратом ТМБ (тетраметилбензидином). Интенсивность формирующегося окрашивания обратно пропорциональна концентрации 25-ОН витамина D в образце. Результаты рассчитываются с помощью стандартной калибровочной кривой.

___________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ НАБОРА

Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не замораживать. Невскрытые компоненты набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока годности набора.

УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ

Обращайтесь с исследуемыми образцами, калибраторами, контролями и проинкубированными стрипами планшетов как с потенциально инфицированными материалами. Все реагенты и материалы, являющиеся отходами, должны быть обработаны в соответствии с действующими нормативами.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ Примечание. Перед использованием все реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (18-

25 °С) примерно в течение 30 минут. После первого использования все реагенты стабильны до истечения указанного срока годности при хранении при температуре 2-8 °С и предохранении от микробной контаминации, если ниже не оговорены особые условия хранения.

-Стрипы с иммобилизованными антителами

Стрипы готовы к использованию. Вскройте предохраняющую упаковку микропланшета за бороздку над застежкой. Перед вскрытием упаковки стрипы должны быть прогреты до комнатной температуры во избежание конденсации влаги внутри лунок. После вскрытия упаковки неиспользуемые стрипы сразу верните в пакет и плотно закройте его имеющейся на пакете самоуплотняющейся застежкой. (Не удаляйте пакет с влагопоглотителем).

После первого вскрытия упаковки стрипы с лунками, покрытыми антигенами, можно хранить в сухом месте при температуре 2-8 °С по меньшей мере в течение 4 месяцев.

-Калибраторы и контроли

Калибраторы и контроли готовы к использованию. Перед использованием тщательно перемешать.

-Биотин

Биотин является 100-кратным концентратом. Перед разведением тщательно перемешать. С помощью пипетки с чистым наконечником отберите необходимое количество концентрата биотина и разведите в буфере для разведения образцов (1 часть биотина плюс 99 частей буфера). Например, 1 мл концентрата биотина плюс 99 мл буфера для разведения образцов.

Приготовленный разведенный биотин стабилен в течение 2 недель при хранении при температуре 2-8 °С. Более длительное хранение возможно при заморозке на -20 °С.

-Буфер для разведения образцов

Буфер для разведения образцов готов к использованию.

-Конъюгат фермента

Конъюгат фермента готов к использованию. Перед использованием тщательно перемешать.

-Промывочный буфер

Промывочный буфер является 10-кратным концентратом. Если в концентрате промывочного буфера образовались кристаллы, необходимо подогреть флакон с буфером при температуре 37 оС и тщательно перемешать перед разведением. С помощью чистой пипетки отберите необходимое количество концентрата буфера и разведите деионизированной или дистиллированной водой (1 часть реагента плюс 9 частей дистиллированной воды).

Приготовленный разведенный промывочный буфер стабилен до истечения срока годности при хранении при температуре 2-8 °С и соблюдении правил использования.

-Раствор хромоген/субстрат

Раствор хромоген/субстрат готов к использованию. Закрывайте флакон сразу после использования, поскольку содержащийся в нем раствор чувствителен к свету. Используемый раствор хромоген/субстрат должен быть бесцветен. Не используйте раствор, если он окрасился в голубой цвет.

-Стоп-реагент

Стоп-реагент готов к использованию.

Внимание! Калибраторы и контроли содержат сыворотку животного происхождения. Однако, все используемые материалы следует считать потенциально инфекционно опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры предосторожности. Часть реагентов содержит токсичный азид натрия. Избегайте контакта реагентов с кожей.

___________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

Исследуемые образцы:

Сыворотка крови или взятая в ЭДТА, гепарин или цитрат плазма крови.

Стабильность

Исследуемые образцы сыворотки или плазмы крови могут храниться до 14 дней при температуре 2-8 °С. Разведенные образцы следует исследовать в течение одного рабочего дня.

Примечание

Разведенные образцы должны использоваться только в одной постановке, а после постановки - утилизироваться. Всегда используйте новые разведения образцов и калибраторов для каждой постановки.

Разведение образцов:

Калибраторы/контроли и образцы пациентов разводят 1:51 рабочим разведением биотина. Образцы пациентов и калибраторов всегда вносите в пробирки для разведения первыми. Затем, в течение 5 минут, добавьте рабочий раствор биотина и оставьте смесь на 10 минут при комнатной температуре.

ПРИМЕР: Добавьте 0,5 мл рабочего раствора биотина к 10 мкл образца и тщательно перемешайте на вортексе. Инкубируйте смесь по крайней мере 10 минут при комнатной температуре (18-25 °С). После этого образцы могут быть внесены в лунки реакционного планшета в соответствии со схемой раскапывания.

ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ Ручная (частично) постановка.

Инкубация образцов

(1-я стадия)

Промывка

Инкубация конъюгата

(2-я стадия)

Промывка

Инкубация субстрата

(3-я стадия)

Остановка реакции

Измерение

___________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

СХЕМА ВНЕСЕНИЯ РЕАГЕНТОВ

Схема внесения реагентов в лунки стрипов 1–3 представляет собой образец заполнения лунок при количественном анализе 16 образцов сыворотки или плазмы крови пациентов (Р1–Р16).

В соответствующие лунки вносят и инкубируют калибраторы (от С1 до С6), контроль 1 (Co 1) и контроль 2 (Со 2), а также образцы пациентов. Достоверность анализа можно увеличить, размещая и измеряя каждую анализируемую пробу в двух параллельных лунках (дубликатах).

Контроли выполняют роль внутренних контролей для проверки правильности процедуры тестирования. Их следует использовать при каждой постановке анализа.

РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Количественный анализ

На графике линейной зависимости откладывают величины ОП, измеренные для 6 калибровочных сывороток (ось Y) против логарифма концентрации антител в этих сыворотках (ось X) (линейнологарифмические оси координат). По полученным точкам строят калибровочную кривую для определения концентрации антител в образцах пациентов. Для расчета кривой с помощью компьютера используйте способ построения кубический сплайн (“cubic spline”) или 4-PL.

Для правильного построения графика в полулогарифмических координатах, необходимо установить концентрацию калибратора 1 отличную от 0, например, 0,1 нг/мл. Ниже приведен пример типичной калибровочной кривой. Не используйте ее, пожалуйста, для определения концентрации антител в образцах пациентов.

ОП

нг/мл

Если значение оптической плотности исследуемого образца лежит ниже значения оптической плотности калибратора 6 (120 нг/мл), результат записывают как “>120 нг/мл. Такой образец рекомендуется развести 1:101 и протестировать повторно, а результат, полученный по калибровочной кривой (нг/мл), умножить на коэффициент разведения 2.

Для определений, проводящихся в дубликатах, следует использовать в расчетах среднее значение двух величин. Если эти две величины существенно расходятся между собой, анализ образца следует повторить.

Для постановки диагноза всегда, кроме результатов серологических исследований, необходимо учитывать клинические симптомы пациента.

___________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Калибровка

Поскольку не существует международной референcной сыворотки для 25-ОН витамина D, калибраторы и контроли калибровались гравиметрически с использованием панели стандартов, верифицированных UV-Vis (264 нм) и сравнивались с данными контроля качества по стандартам NIST (Национального института стандарта и технологий, США), DEQAS (Система внешнего контроля качества по витамину D, Великобритания) и сыворотками внутреннего контроля качества.

Для каждой группы выполненных тестов значения концентраций контролей, должны укладываться в указанные для данной серии набора диапазоны. К набору прилагается протокол, включающий эти целевые значения. Если значения концентраций контролей выходят за рамки заданных диапазонов, следовательно, результаты анализа могут быть недостоверными, и тест необходимо повторить.

Антитела

На поверхности лунок планшета иммобилизованы моноклональные антитела, которые специфически связываются с 25-ОН витамином D2 и 25-ОН витамином D3.

Аналитическая чувствительность

Предел определения 25-ОН витамина D в 25-ОН витамин D ИФА рассчитан на основании значения оптической плотности образца, не содержащего аналита, плюс утроенное среднее квадратичное отклонение, и является наименьшей определяемой концентрацией 25-ОН витамина D. Предел определения набора 25-ОН витамин D ИФА составляет 1,9 нг/мл.

Перекрестная реактивность

Данный ИФА-набор специфически выявляет 25-ОН витамин D2 и 25-ОН витамин D3. Перекрестная реактивность с другими метаболитами представлена в таблице.

Перекрестная реактивность в %

Влияние гемоглобина, триглицеридов и билирубина

Не отмечено искажения результатов при исследовании данным набором гемолизированных, липемических или желтушных образцов с концентрацией гемоглобина до 10 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и билирубина – до 0,4 мг/мл.

Воспроизводимость

Воспроизводимость ИФА оценивали по коэффициенту вариации (CV) в пределах одной постановки и между постановками, проводя повторные исследования 3 образцов сыворотки крови с различной концентрацией аналита. Коэффициент вариации в пределах одной постановки оценивали по 20 определениям, коэффициент вариации между постановками – по 4 измерениям, выполненным в течение 6 разных постановок.

___________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

Линейность

Линейность теста исследовали путем разбавления трех сывороток калибратором 1 и анализируя согласованность результатов. Средняя согласованность составила 107% (99-115%).

Сравнение с другими методами: ИФА-наборы EUROIMMUN сравнивался с различными референсными тестами и показал следующую корреляцию:

Ожидаемые значения

Уровни 25-ОН витамина D анализировали, используя ИФА набор EUROIMMUN на панели сывороток от 354 здоровых доноров крови, в возрасте от 19 до 68 лет. Среднее значение концентрации 25-ОН витамина D составило 28 нг/мл с 5-95% перцентилем в диапазоне 9,3 – 52 нг/мл.

Метод оценки был изменен в соответствии с Hollick, MF Vitamin D Deficiency. N Engl J Med 2007;357:266-28.

___________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

25-ОН витамин D, ожидаемые значения, n=354

Образцы доноров крови

Диапазоны в нг/мл

Каждая лаборатория должна устанавливать ожидаемые значения 25-ОН витамина D самостоятельно.

Пересчет единиц:

25-ОН витамина D3 (нг/мл) х 2.5 = 25-ОН витамина D3 (нмоль/л)

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Набор 25-ОН витамина D ИФА предназначен для серологического определения концентрации витамина D в человеческом организме. К дифференцированным типам витамина D относятся витамин D2 (эргокальциферол), который содержится в растительной пище (грибы, авокадо) и витамина D3 (холекальциферол), который продуцируется из 7–дегидрохолестерина в коже под воздействием УФоблучения или содержатся в пище животного происхождения и других продуктах (морская рыба, яичный желток, сливочное масло) [1, 2, 3, 4, 5]. Эти две формы витамина D, которые еще не являются биологически активными соединениями, связываются с белком VDBP(vitamin D binding protein, витамин D-связывающий белок) в крови, а затем метаболизируются в печени и превращается в 25-ОН витамин D2 (кальцидол) и 25ОН витамина D3 (кальцитриол) соответственно, которые являются формами запасания витамина с невысокой активностью [1, 4]. В отличие от других коммерчески доступных тестов, в ИФА используются недавно полученные моноклональные антитела, которые одинаково специфичны к обеим формам витамина. Такая специфичность необходима, потому что иногда в терапии используется не D3, а D2 [6, 7, 8].

Витамин становится 1,25-дигидрокси витамин D - биологически активным метаболитом, который функционирует как гормон (D-гормон) – только через дополнительный этап переработки в почках [1, 4]. D- гормон регулирует усвоение кальция из кишечника, минерализацию костей, дифференциацию остеобластов и синтез костного матрикса. Среди прочего, D-гормон также влияет на нейромышечные функции [1].

Сывороточный уровень 25-ОН витамина D, который из всех метаболитов в крови хранит больше всего витамина D, является лучшим индикатором поступления витамина D в организм человека.

Во всем мире дефицит витамина D является серьёзной проблемой с тяжелыми последствиями для здоровья [1, 4, 6]. Незначительный дефицит витамина D, определяемый как уровень 25-ОН витамина D в диапазоне 12-30 нг/мл (30-75 нмоль/л) в крови, достаточен для того, чтобы вызвать вторичное повышение паратгормона и более высокий уровень остеолиза [1, 9]. В Германии, концентрации витамина D у лиц, старше 50 лет значительно связаны с плотностью костной ткани [10]. Таким образом, дефицит витамина D является одним из наиболее важных факторов риска развития старческого остеопороза [1, 2, 3, 11]. Раннее выявление дефицита витамина D позволяет проводить эффективную профилактику переломов (особенно шейки бедра и лучевой кости) путем добавления в рацион витамина D [6, 12, 13]. Тяжелый дефицит витамина D (при уровне 25-OH витамина <12 нг/мл (<30 нмоль/л)) приводит, например, к рахиту у детей и остеомаляции у взрослых; оба этих состояния характеризуются дефектами роста костей и минерализации костной ткани [14].

Аномальные сывороточные уровни витамина D могут быть основными или дополнительными факторами, вызывающими многие заболевания. Так как лечение синдромов, вызванных дефицитом витамина D, должно начинаться как можно раньше и часто имеет длительный характер, иногда в течение многих лет и десятилетий, ИФА определение 25-ОН витамина D представляет собой важный инструмент для контроля терапии, тем более, что индивидуальные реакции пациентов на лекарства сильно различаются [4, 15].

Показания к использованию ИФА-набора 25-ОН витамин D [4, 16, 17]:

___________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________

•подозрение на дефицит витамина D

•снижение всасывания витамина D в кишечнике

•повышение уровня обмена витамина D

•гипокальциемия

•гипофосфатемия

•гипокальциурия

•повышение уровня щелочной фосфатазы

•снижение минерализации костей

•подозрение на передозировку витамина D

Снижение сывороточного уровня 25-ОН витамина D наблюдается при [4, 9]:

•недостаточном пребывании на солнце

•питании, дефицитном по витамину D

•снижении всасывания витамина D в кишечнике при нарушении абсорбции жира, билиарном циррозе и экзокринной недостаточности поджелудочной железы

•медикаментозном увеличении уровня обмена витамина D (например, при приеме противосудорожных препаратов) и при первичном гиперпаратиреозе

•потере витамина D (нефритический синдром, перитонеальный диализ)

•тяжелых повреждениях паренхимы печени

•наблюдается при следующих лабораторных результатах:

-гипокальциемия

-гипофосфатемия

-гипокальциурия

-повышенный уровень щелочной фосфатазы

-повышенный уровень ПТГ (паратгормона)

Гиповитаминоз витамина D является фактором риска для:

•аутоиммунных заболеваний (например, рассеянный склероз, болезнь Крона, сахарный диабет 1 типа, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Паркинсона) [6, 10, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32]

•инфекционных заболеваний (например, инфекции дыхательных путей, туберкулез) [6, 33, 34, 35, 36]

•артериальной гипертонии [6, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43]

•злокачественных опухолей (например, рак толстой кишки, молочных желез, яичников, предстательной железы, поджелудочной железы, пищевода, гипернефрома, лейкемия) [28, 29, 31, 44, 45, 46, 47]

•сердечно-сосудистых заболеваний [28, 31, 38, 48, 49, 50]

•заболеваний опорно-двигательного аппарата [28, 31, 51, 52]

•асептического некроза костей (например, медиальной кости, проксимального отдела большеберцовой кости, болезнь Блаунта) [53]

•снижение познавательных способностей, деменция [26, 28, 38]

•атопический дерматит [54]

•психические расстройства (например, депрессия) [28, 38, 55]

•гипертриглицеридемия у детей [56]

Повышение сывороточного уровня 25-ОН витамина D наблюдается при передозировке витамина D во время лечения (интоксикация), а также у пациентов с гиперпаратиреозом [4].

В соответствии с действующими рекомендациями в Европе и США, потребление витамина D3 должно составлять около 5 мкг (200 МЕ) для детей и взрослых, около 10 мкг для людей 50-70 лет, и около 15 мкг для людей старше 70 лет [2, 3, 10, 11, 14, 15, 17, 57, 58, 59]. Передозировка витамина D может вызвать синдромы гиперкальциемии [1, 33]. Медикаментозное лечение остеопороза основано на оральном потреблении витамина D и кальция [6, 12, 14].

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.

Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см. внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо руководствуйтесь оригиналом инструкции.

___________________________________________________________________________________________